臨床微生物學檢驗：20-細菌耐藥性檢測

細菌耐藥性檢測

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細菌的藥敏試驗為臨床治療嚴重細菌感染患者提供最直接的依據，這就要求臨床微生物學實驗室提供最可靠的藥敏結果，同時有能力做新藥的藥敏。

醫(yī)院感染的主要原因之一是抗菌藥物的使用不當。

合理使用抗菌藥物的前提之一是要重視感染病原學的實驗室診斷和監(jiān)控抗感染治療的實驗室服務。

藥物敏感試驗包括體外抗菌藥物敏感試驗、體內抗菌藥物活性的測定和藥物濃度的測定。常用的體外抗菌藥物敏感試驗有

紙片擴散法、稀釋法和E試驗法。本章僅對臨床微生物實驗室常用的體外藥敏試驗的基本原理和方法進行介紹。一、臨床常用的抗菌藥物抗菌藥物是指具有殺菌或抑菌活性的抗生素和化學合成藥物。1.

青霉素類抗生素2.

頭孢菌素類抗生素：四代3.

其他-β內酰胺類抗生素：舒巴坦4.

氨基糖甙類抗生素:鏈霉素,慶大5.

喹諾酮類抗生素：沙星類6.

大環(huán)內酯類抗生素：紅霉素，阿奇7.

糖肽類抗生素：萬古霉素，替考拉寧8.

磺胺類藥物及增效劑：復方新諾明

9.

四環(huán)素、氯霉素和林可霉素10.

其他抗菌藥：甲硝唑二、抗菌藥物敏感性試驗（antimicrobialsusceptibilitytest,AST）

抗菌藥物敏感性試驗意義在于：1.可預測抗菌治療的效果。既AST試驗結果為“敏感”時，治療可能有效；試驗結果為“耐藥”時，使用該藥物治療肯定失??；2.指導臨床醫(yī)生選擇使用抗生素。

AST的結果往往在給予病人經驗性治療24~48h之后，若AST結果為“敏感”，該治療為有效，若結果為“耐藥”，即應更換藥物；“中介”。3.發(fā)現(xiàn)或提示細菌耐藥機制的存在，能幫助臨床醫(yī)生選擇合適的藥物，避免產生或加重耐藥；4.監(jiān)測耐藥性，分析耐藥菌的變遷，掌握耐藥菌感染病的流行病學，以控制和預防耐藥菌感染的發(fā)生和流行。藥敏試驗方法1紙片擴散法

1）Kirby-Bauer（K-B）紙片瓊脂擴散法（1）實驗原理：定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上。藥物梯度擴散，紙片周圍形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度。并與該藥對測試菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負相關關系。即抑菌圈愈大，MIC愈小。(2)

抗菌藥物紙片：選擇直徑6.35mm的新華濾紙含藥物紙片，-20℃保存。室溫平衡。

(3)

培養(yǎng)基：用水解酪蛋白（Mueller-HintonMH）瓊脂。瓊脂厚度4mm。9cm內徑的平板需傾注25-30ml瓊脂，7cm內徑的平板需傾注15ml瓊脂。對于營養(yǎng)要求高的細菌在MH瓊脂基礎上加入血清或血液。

(4)

操作步驟：

接種在已分純的待測菌平板上挑取4~5個菌落

35℃4~6h

3~5mlMH肉湯中用肉湯調整菌液至

15min內0.5個麥氏管（1.5х108/ml）用無菌棉簽均勻涂布平板（涂布3次，每次旋轉平板60度，最后沿平板內緣涂抹1周）

室溫5分鐘后貼紙片（各紙片中心相距應大于24mm，紙片距平板內緣應大于15mm）

35℃16-18h

觀察結果紙片擴散法水解酪蛋白（MH）培養(yǎng)基，pH7.2～7.4，做成瓊脂厚度4mm，直徑90mm的平板；挑取孵育16～24小時已分純菌落，置于生理鹽水管中，振蕩混勻后校正濃度至0.5麥氏標準。

紙片擴散法用無菌棉拭子蘸取菌液，在試管內壁旋轉擠去多余菌液；然后在MH瓊脂表面均勻涂布接種3次，每次旋轉平板60度；最后沿平板內緣涂抹1周；平板在室溫下干燥3～5min，用無菌鑷子或商品化的紙片分配器將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心距離應大于24mm，紙片距平板內緣大于15mm。紙片擴散法35℃孵育16～24小時量取抑菌圈直徑；根據抑菌環(huán)的直徑，按照CLSI標準判讀，報告敏感、中介、耐藥。

5.

結果判斷：量取抑菌圈直徑

抗菌藥物敏感性標準分為以下三級：

敏感：表示測試菌能被測定藥物常規(guī)劑量給藥后在體內達到的血藥濃度所抑制或殺滅。

中度敏感(中介)：指測試菌可被測定藥物大劑量給藥后在體內能達到的濃度所抑制，或在測定藥物濃集部位的體液中，如尿中被抑制。

耐藥：表示測試菌不能被在體內感染部位可能達到的抗菌藥物濃度所抑制。

6.

影響因素

（1）

培養(yǎng)基的質量，如PH、深度、硬度和表面濕度等；

（2）

藥敏紙片的質量，含藥量和保存方式；

（3）

接種菌量正確與否是影響結果的重要因素之一，取決于比濁標準的配制，正確使用和保存；（4）

試驗操作質量：接種細菌后貼片時5~15分鐘；

（5）

孵育條件，溫度和時間：培養(yǎng)時間16~18h,不要超過24h。

7.

質量控制

采用標準菌株：金黃色葡萄球ATCC25923，大腸埃希菌ATCC25922，和銅綠假單胞菌

ATCC27853

2）直接紙片藥敏法

由確證感染部位采集到的一些重要臨床標本直接涂布接種MH瓊脂或5%羊血MH瓊脂，然后放置藥敏紙片。不僅可提早24h得出初步藥敏結果供臨床用藥參考，還有助于發(fā)現(xiàn)混合感染中的不同菌種、耐藥菌株以及病原菌的鑒定。但由于此法難以控制接種菌量，且標本中可能存在多種細菌，因此還需要在病原菌分純后再用K—B法對其進行驗證和補充。

2稀釋法1）

肉湯稀釋法包括試管稀釋法和微量稀釋法。下面重點講述試管稀釋法（常量稀釋法）。（1）原理：以水解酪蛋白（MH）液體培養(yǎng)基將抗生素作不同濃度的稀釋，然后種入待測細菌，定量測定抗菌藥物對被測菌的最低抑菌濃度(MIC)或最低殺菌濃度（MBC）。

最低抑菌濃度（minimalinhibitoryconcentration,MIC）：細菌生長被完全抑制的最低藥物濃度為該藥對測試菌的MIC。

最低殺菌濃度（minimalbactericidalconcentration,MBC）：某抗菌藥物能殺滅99.9%以上測試菌時的最低藥物濃度。試管編號：抗生素：2ml(512μg/ml)MH肉湯抗生素含量菌液(ml)：（1.5×107

/ml)123456789101ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml

2561286432168421---不加抗生素0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.11ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml(棄去)對倍稀釋：(2)方法注意:設立對照管(肉湯對照管,待測菌生長對照管和質控菌生長對照管.（3）結果判斷:不出現(xiàn)肉眼可見生長的最低藥物濃度為該藥對該細菌的MIC.如第六管不出現(xiàn)肉眼可見生長,則MIC=原藥物濃度(512μg/ml)×稀釋倍數(1:64)=8μg/ml

將所有無菌生長的試管轉移到血平板，培養(yǎng)過夜，平板上無菌落生長的最低藥物濃度為藥對該菌的MBC.混勻35℃16~20h觀察結果（4）影響因素：培養(yǎng)基、接種菌量、蛋白質結合率、抗菌藥物的配制、結果觀察的時間等因素均能影響本試驗的結果。（5）質量控制：每批或每次實驗時應根據測試菌種類分別選用金黃色葡萄球菌ATCC25923，大腸埃希菌ATCC25922，糞腸球菌ATCC29212和銅綠假單胞菌ATCC27853等標準菌株在同一試驗條件下進行測定。2）

瓊脂稀釋法（1）原理：將藥物混勻于MH瓊脂平板上，配制含不同濃度藥物平板，使用多頭接種器接種細菌，孵育后觀察細菌生長情況，以抑制細菌生長的瓊脂平板所含的藥物濃度測得MIC。（2）方法：將0.5麥氏管菌液稀釋10倍以多頭接種器接種于瓊脂表面，稀釋的菌液15min內接種完畢，置35℃孵育16~20h。（3）質量控制：原則同肉湯稀釋法，每個瓊脂平板應同時接種標準菌株。3E試驗

E試驗是一種結合稀釋法和擴散法原理對微生物藥敏試驗直接定量的技術。（1）原理

E試條是一條5mm×50mm的無孔試劑載體，一面固定有一系列預先制備的，濃度呈連續(xù)指數增長的稀釋抗生素，另一面有讀數和判別的刻度。圈的邊緣與試條交點的刻度濃度即為抗生素抑制細菌的特定濃度，又稱抑制濃度（IC），它與MIC呈高度相關。

E試驗（2）方法菌液、平板接種等同紙片瓊脂擴散法,待瓊脂平板完全干燥，用E試驗加樣器或鑷子將試條放在已接種細菌的平板表面，試條全長應與瓊脂平板緊密接觸，試條MIC刻度面朝上，濃度最大處靠平板邊緣。

（3）結果判讀：讀取橢圓環(huán)與E試驗試條的交界點IC值。細菌生長區(qū)抑菌圈含藥試條最低抑菌濃度

4聯(lián)合藥物敏感試驗1）聯(lián)合藥敏試驗的方法聯(lián)合藥敏試驗的方法很多，其中紙片法最為常用。先將試驗菌均勻涂布于培養(yǎng)基表面，蓋好平皿，放置5分鐘，待平板表面水分吸收后，將兩種含藥紙片貼于平板上，兩紙片中心距離2--4mm左右。然后35℃孵育過夜，取出觀察結果。意義：①治療混合感染②預防或推遲細菌耐藥性的發(fā)生③聯(lián)合用藥可以減少劑量以避免達到毒性劑量④聯(lián)合用藥比單一用藥效果好2）結果判斷聯(lián)合藥物敏感試驗可出現(xiàn)四種結果：A.無關作用：甲+乙=甲單或乙單B.拮抗作用：甲+乙＜甲單或乙單C.相加作用：甲+乙=甲單+乙單D.協(xié)同