土壤微生物的分離鑒定

土壤微生物的分離鑒定實驗報告09級生科一班(周一下午組)安明玉同組者：陳汶燦、程彬、陳肖然、高琳璐、秦瑤一、實驗摘要利用分離純化微生物的基本操作技術(shù)對土壤中的微生物進(jìn)行分離與純化，根據(jù)菌落形態(tài)觀察染色鑒定以及一系列的生理生化試驗的結(jié)果通過查閱《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》對照種屬特征最終判斷所分離純化的細(xì)菌所屬的屬。二、實驗?zāi)康膶W(xué)會設(shè)計實驗方案，分離目的菌，并通過后續(xù)實驗做出初步鑒定。掌握倒平板和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術(shù)。鞏固練習(xí)顯微鏡使用方法。明確培養(yǎng)基的配制原理，復(fù)習(xí)配制培養(yǎng)基及消毒滅菌的一般原理和操作步驟。復(fù)習(xí)掌握細(xì)菌稀釋分離和劃線分離技術(shù)，平板傾注法和斜面接種技術(shù)，了解培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間，復(fù)習(xí)平板菌落計數(shù)法。復(fù)習(xí)掌握細(xì)菌的簡單染色、鞭毛染色、革蘭氏染色的基本原理和操作方法。學(xué)習(xí)并掌握過氧化氫酶測定、細(xì)胞色素氧化酶測定和糖發(fā)酵與氧化試驗的實驗原理及其操作方法。三、實驗原理對土壤中微生物的分離篩選及鑒定從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程成為微生物的分離與純化，常用的方法有簡易的細(xì)胞挑取法和平板分離法。本實驗采用平板分離法，該方法操作簡單，普遍用于微生物的分離與純化，其原理包括以下兩個方面：(1)在適合于待分離微生物的生長條件(如營養(yǎng)、酸堿度、溫度與氧等)下培養(yǎng)微生物，或加入某種抑制劑形成只利于待分離微生物的生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物；(2)微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落可以是由一個細(xì)胞繁殖而成的集合體，因此可通過挑取單菌落而獲得純培養(yǎng)，獲得單菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等方法完成。但是從微生物群體中經(jīng)分離生長在平板上的單個菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落的特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征后才能確定。有的微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過一系列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。土壤是微生物生活的大本營，它所含有的微生物無論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。土壤是微生物多樣性的重要場所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離純化得到許多有價值的微生物菌株。顯微鏡的使用及細(xì)胞的簡單染色和革蘭氏染色現(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來放大成像，故又常稱為復(fù)試顯微鏡。在顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)中，物鏡的性能最為關(guān)鍵，對微生物學(xué)研究最為重要，直接影響顯微鏡的分辨率。與其他物鏡相比，油鏡的使用方法比較特殊，需要在載玻片和鏡頭之間滴加香柏油。這樣做有兩個原因。一是能夠增加照明亮度，如果光線只是經(jīng)過空氣進(jìn)入物鏡，會因為工作焦距很短，有些光線發(fā)生折射或全反射，進(jìn)入物鏡的光線少而使視野亮度不夠；而滴加香柏油后，因為香柏油與玻璃的折射率相仿（玻璃，n=1.5,香柏油，n=1.52）,可以保證視野亮度。二是增加顯微鏡的分辨率。利用單一染料對菌體進(jìn)行染色稱為簡單染色。通常用堿性染料進(jìn)行簡單染色，原因在于微生物細(xì)胞在堿性、中性、弱酸性溶液中通常帶負(fù)電荷，而染料電離后染色部分帶正電荷，很容易與細(xì)胞結(jié)合壁著色；當(dāng)細(xì)胞處于酸性條件下（如細(xì)胞分解糖類產(chǎn)物）所帶正電荷增加時，可采用酸性染料染色。革蘭氏染色，革蘭氏染色法是復(fù)（特殊）染色法中一種最重要的鑒別性染色法之一。該染色法是先將細(xì)菌用結(jié)晶紫染色，再加媒染劑碘液媒染以增加染料和細(xì)菌細(xì)胞的親和力，使它和結(jié)晶紫在菌體細(xì)胞壁部位形成分子量較大的紫碘復(fù)合物，而后用脫色劑酒精或丙酮脫色，最后再用復(fù)染劑番紅復(fù)雜。如果細(xì)菌經(jīng)脫色劑酒精或丙酮處理后不被脫色而保存初染顏色即紫色，即為“革蘭氏陽性菌”；若初染被脫色而染上復(fù)染劑番紅顏色即淡紅色，則為“革蘭氏陰性菌”。革蘭氏陽性菌的肽聚糖層厚而致密，經(jīng)過媒染和染色后顏色不易被洗掉，而呈現(xiàn)紫色；而陰性菌肽聚糖層僅1-2層，層薄而疏，與染色劑結(jié)合不緊密，顏色容易被洗掉而被番紅復(fù)復(fù)染成紅色。革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個步驟，但在具體操作方法上有多種做法。菌株鑒定的生理生化實驗（1）糖發(fā)酵與氧化試驗在細(xì)菌的分類鑒定中，糖類發(fā)酵與氧化測定是一項重要依據(jù)。特別是對細(xì)菌的鑒定尤為重要。常用的發(fā)酵與氧化的糖類包括單糖，雙糖，多糖三類：如葡萄糖，蔗糖，淀粉等。醇類包括五元醇，六元醇;如到金盞花醇，甘露醇等；糖苷類主要包括有水楊苷等。絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為能源和碳源，但由于不同的菌類存在酶類差異，已而對糖類發(fā)酵與氧化的能力就有所不同。有的能利用這種而不能利用那種，有的正好相反；有的在糖類發(fā)酵與氧化代謝中能分解糖類，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的則只能產(chǎn)酸不能產(chǎn)氣。酸產(chǎn)生與否，以及時發(fā)酵類型產(chǎn)酸還是氧化類型產(chǎn)酸，可以由預(yù)先加在培養(yǎng)基中的指示劑（溴百里酚藍(lán)水溶液）呈現(xiàn)出來。這樣把接好菌種的培養(yǎng)基放在厭氧或好樣的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)辄S色為產(chǎn)酸，是否產(chǎn)氣是通過觀察培養(yǎng)基中是否產(chǎn)生氣泡或培養(yǎng)基斷裂來測定，如產(chǎn)生斷裂或有氣泡證明由氣體存在。（2）過氧化氫酶測定乳酸菌和許多厭氧菌與其他細(xì)菌區(qū)分的主要依據(jù)是測定有無過氧化氫酶。過氧化氫酶又稱接觸酶，它能把過氧化氫分解為水和氧氣，氧分子變做氣泡跑出來，則為過氧化氫酶陽性。乳酸菌和許多厭氧菌在過氧化氫試驗中呈陰性。（3）細(xì)胞色素氧化酶測定細(xì)胞色素氧化酶是氧化酶中的一種，有時人們習(xí)慣的把細(xì)胞色素氧化酶稱為氧化酶，所以在細(xì)菌分類鑒定中所說的氧化酶就是指細(xì)胞色素氧化酶。細(xì)胞色素氧化酶在右分子氧和細(xì)胞色素C存在時，可氧化二甲基對本撐二胺（氨基二甲基苯胺），使之呈現(xiàn)玫瑰紅到暗紅色，在此基礎(chǔ)上，還能和a-苯酚結(jié)合生成吲哚酚藍(lán)，而出現(xiàn)藍(lán)色。四、實驗試劑與器材器材培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、普通光學(xué)顯微鏡、量筒、滴管、吸水紙、燒杯、三角瓶、電爐、玻璃棒、接種環(huán)、鑷子、恒溫培養(yǎng)箱、高溫滅菌鍋、電子天平、濾紙、pH試紙等。試劑牛肉膏、NaCI、瓊脂、蛋白胨、葡萄糖、K2HPO3、溴百里酚藍(lán)、甘油（丙三醇）、結(jié)晶紫染液、番紅染液、碘液、95％乙醇、5％孔雀綠染液、0.5％番紅水染液、3％過氧化氫水溶液、1％鹽酸二甲基對苯撐二胺溶液、蒸餾水等。土樣公教樓前綠化帶內(nèi)約5cm深處。五、實驗步驟1.配置培養(yǎng)基配置牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和馬鈴薯培養(yǎng)基各300mL,包好15個培養(yǎng)皿，6支試管，玻璃鏟及移液管，與配好的培養(yǎng)基一起121°C滅菌30分鐘。滅菌后將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中（無菌操作），牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒9個平板，馬鈴薯培養(yǎng)基倒6個平板。制備土壤稀釋液采集土壤樣品，稱取土壤10g,放入90mL無菌水的三角瓶中，振蕩，并用玻璃珠打碎，靜置30min，配成土壤懸液。配制稀釋液用移液管從三角瓶中吸取1ml（此操作要求無菌操作），加入另一盛有9ml無菌水的離心管中，混合均勻，以此類推分別制成0.1、0.01、0.001、0.0001和0.00001不同稀釋度的土壤溶液。涂布培養(yǎng)倒平板，待平板冷卻凝固后，無菌操作，移取0.2ml稀釋液至平板培養(yǎng)基上，并充分混勻鋪平。其中，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（細(xì)菌）所接梯度為0（即原液），0.01，0.00001；馬鈴薯培養(yǎng)基（霉菌）所接梯度為0,0.001。每種各接3板，做好標(biāo)記。倒置于37C下恒溫培養(yǎng)24~48ho（馬鈴薯培養(yǎng)基置于28C培養(yǎng)3天）。觀察各個稀釋條件下的菌落數(shù)（最大稀釋度下，保證菌落數(shù)不超過30，否則應(yīng)繼續(xù)稀釋。）計算出每克土壤中細(xì)菌的數(shù)量:1g土壤中的細(xì)菌數(shù)量=每皿菌落平均數(shù)X稀釋倍數(shù)X1/取樣體積數(shù)X9劃線分離土壤稀釋溶液微生物的培養(yǎng)基平板進(jìn)行觀察，記錄區(qū)分明顯的細(xì)菌特征。細(xì)菌培養(yǎng)基上挑取選5個菌落，標(biāo)記，記錄并進(jìn)行菌落描述，然后將選取的5種細(xì)菌在新的培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)（每種細(xì)菌培養(yǎng)3個培養(yǎng)皿），標(biāo)號，37°C溫箱培養(yǎng)。6?簡單染色，觀察記錄現(xiàn)象，如果細(xì)菌不純，繼續(xù)平板劃線分離直到得到純菌種。挑取純菌種接種于斜面培養(yǎng)基上保存。半固體穿刺實驗，觀察菌的運動性。芽孢染色，觀察記錄現(xiàn)象o9?革蘭氏染色，觀察記錄現(xiàn)象。10.生理生化實驗（1）淀粉水解實驗（2）糖發(fā)酵試驗11?通過查伯杰手冊確定菌屬。六、實驗結(jié)果細(xì)菌分離鑒定結(jié)果（1）菌落計數(shù)項目平皿編號平均稀釋倍數(shù)1g土壤中細(xì)菌數(shù)123計數(shù)14162016.710-515.03x106（2）菌落描述編號大小顏色形狀33干/濕表面邊緣透明程度13.0mm乳白色圓形濕不隆起，不光滑不整齊不透明24.0mm乳白色圓形濕不隆起整齊不透明2.5mm白色圓形濕不隆起整齊不透明46.5mm淡黃色圓形濕略微隆起，表面光滑不整齊稍透明54.5mm乳白色圓形濕不隆起，不光滑不整齊不透明其中4號菌體周圍有似粘液的物質(zhì)包圍，且不易挑起染色結(jié)果染色類型編號12345簡單染色直桿狀，呈短鏈直桿狀短桿狀，呈短鏈直桿狀直桿狀，鏈狀排列芽孢顏色形成芽孢，位于菌體中部不產(chǎn)生芽孢不產(chǎn)生芽孢不產(chǎn)生芽孢形成芽孢，稍偏離菌體中部革蘭氏染色陽性陽性陰性陰性陽性半固體穿刺實驗編號12345是否運動運動不運動不運動運動運動生理生化反應(yīng)結(jié)果（1）淀粉水解實驗編號12345現(xiàn)象出現(xiàn)透明圈出現(xiàn)透明圈出現(xiàn)透明圈不出現(xiàn)透明圈出現(xiàn)透明圈結(jié)論陽性陽性陽性陰性陽性5屬于芽孢桿菌屬，但不同種。通過淀粉水解試驗可以確定15屬于芽孢桿菌屬，但不同種。（2）油脂水解實驗編號12345結(jié)果變紅變紅不變紅不變紅變紅結(jié)論陽性陽性陰性陰性陽性（3）糖發(fā)酵試驗A表示葡萄糖發(fā)酵B表示乳糖發(fā)酵編號12345ABABABABAB是否產(chǎn)酸是否產(chǎn)氣結(jié)論：5種菌均可發(fā)酵葡萄糖，且產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；都不能發(fā)酵乳糖。通過查閱伯杰手冊，得到的鑒定結(jié)果：號菌：細(xì)胞桿狀，呈短鏈，革蘭氏反應(yīng)陽性，有芽孢，運動，淀粉水解測定為陽性，油脂水解測定為陽性,代謝為發(fā)酵型，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。查伯杰氏手冊估計為芽抱桿菌屬(Bacillussp.)。號菌：細(xì)胞桿狀，革蘭氏反應(yīng)陽性，不產(chǎn)生芽孢，不運動，淀粉水解測定為陽性，油脂水解測定為陽性，代謝為發(fā)酵型，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。查伯杰氏手冊為乳桿菌屬(Lactobacillus.sp.)。號菌：細(xì)胞桿狀，呈短鏈，革蘭氏反應(yīng)陰性，不產(chǎn)生芽孢，不運動，淀粉水解測定為陽性，油脂水解測定為陰性，代謝為發(fā)酵型，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。查伯杰氏手冊為不動桿菌屬(Acinetobactersp.)。號菌：細(xì)胞桿狀，革蘭氏反應(yīng)陰性，不產(chǎn)生芽孢，運動，淀粉水解測定為陰性，油脂水解測定為陰性，代謝為發(fā)酵型，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。查伯杰氏手冊為拜葉林克氏菌屬(Beijerinckiasp.)。號菌：細(xì)胞桿狀，鏈狀排列，革蘭氏反應(yīng)陽性，有芽孢，運動，淀粉水解測定為陽性，油脂水解測定為陽性，代謝為發(fā)酵型，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。查伯杰氏手冊為芽抱桿菌屬(Bacillussp.)。通過觀察小室培養(yǎng)的霉菌，得到霉菌觀察結(jié)果：菌種菌絲有無隔菌絲特點有無假根孢子囊、孢囊孢子的形態(tài)特征根霉(Rhizopus)無從孢子?；堪l(fā)出匍匐菌絲有假根處向上叢生直立、不分枝的孢囊梗，頂端膨大形成圓形的孢子囊。青霉(Penicillium)有營養(yǎng)菌絲無色或淡色無分生孢子梗有橫隔，基部無足細(xì)胞。孢子梗頂端不形成膨大的頂囊，而是產(chǎn)生帚狀體。

附錄1.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)細(xì)菌用）的配制牛肉膏蛋白胨NaCl瓊脂水p