鋰-匹羅卡品顳葉癲癇大鼠的早期死亡行為

鋰-匹羅卡品顳葉癲癇大鼠的早期死亡行為

氯化鋁-多酚魯酯的點燃大鼠癲癇模型具有相似的人類癲癇可持續(xù)狀態(tài)（se）或葉癲癇的特征。病理學研究證實匹羅卡品致癇能誘發(fā)海馬門區(qū)神經(jīng)元死亡及苔蘚出芽,類似于人類顳葉癲癇的臨床及病理特征,是理想的顳葉癲癇模型,適用于探討顳葉癲癇形成機理及篩選抗癲癇藥物,用于SE及復雜部分性發(fā)作的分子生物學和電生理等多方面研究。我們對這一模型制作的穩(wěn)定性、重復性及致癇大鼠早期死亡原因,作了進一步的探討及研究。數(shù)據(jù)和方法1.實驗前適應飼養(yǎng)SPF級健康成年雄性Wistar大鼠60只,體重170～200g,由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供(合格證號0050669),由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院動物實驗中心飼養(yǎng)。實驗前適應性飼養(yǎng)一周,觀察無自發(fā)性癲癇發(fā)作入選。所有大鼠隨意飲水、進食,保持12h白晝及12h黑夜的周期環(huán)境。2.水、糖、甲醛等為酰氯醛、五%葡萄糖鈉溶液氯化鋰(溶于生理鹽水,美國Sigma公司)、匹羅卡品(溶于生理鹽水,日本W(wǎng)akoPureChemican)、硫酸阿托品(1ml∶0.5mg)、地西泮注射液(2ml∶10mg)、10%水合氯醛、5%葡萄糖氯化鈉溶液;多功能神經(jīng)電生理監(jiān)測儀(美國AXON)、電子分析天平等。3.小鼠癲癇發(fā)作試驗根據(jù)SPSS統(tǒng)計軟件產(chǎn)生隨機數(shù)字后,將60只大鼠隨機分為生理鹽水對照組10只、癲癇模型組50只。氯化鋰127mg/kg腹腔注射,18～24小時后給予硫酸阿托品1mg/kg腹腔注射,30min后首劑腹腔注射匹羅卡品30mg/kg,30分鐘后如無Ⅳ級以上發(fā)作,可每隔15分鐘注射10mg/kg追加劑量,直至出現(xiàn)Ⅳ級以上無明顯間歇的SE,每只大鼠總量不超過50mg/kg。SE后l小時,腹腔注射地西泮10mg/kg終止SE以降低死亡率,如效果不佳可于30min后再注射1次。對照組予以相同體積的生理鹽水腹腔注射。大鼠癲癇發(fā)作癥狀采用Racine(1972年)分級標準:0級:無任何反應;Ⅰ級:面部陣攣,包括眨眼、動須、節(jié)奏性咀嚼等;Ⅱ級:Ⅰ級加節(jié)律性點頭;Ⅲ級:Ⅱ級加前肢肌陣攣,但無后肢直立位;Ⅳ級:Ⅲ級加后肢直立位;Ⅴ級:全面性強直-陣攣發(fā)作,并失去體位控制。點燃出現(xiàn)RacineⅣ級以上并存活者入組。SE后1周內(nèi),每天給予5%葡萄糖氯化鈉3～5ml腹腔注射,2次/天,加強能量供給。結果1.racine模型腹腔注射氯化鋰未見RacineⅢ級或以上癲癇發(fā)作癥狀。首次注射匹羅卡品30mg/kg未出現(xiàn)RacineⅣ級或以上者12只(24%);第一次追加匹羅卡品10mg/kg,上訴未達標中5只出現(xiàn)RacineⅣ級或以上癲癇發(fā)作癥狀;第二次追加匹羅卡品10mg/kg,剩余未達標中3只出現(xiàn)RacineⅣ級或以上癲癇發(fā)作癥狀。造模過程中癥狀Racine分級統(tǒng)計,其中Ⅰ級3只(3/50),Ⅱ級4只(4/50),Ⅲ級5只(5/50),Ⅳ級16只(16/50),Ⅴ級22只(22/50)。癲癇模型組點燃最后出現(xiàn)RacineⅣ級以上者46只(92%)。生理鹽水對照組動物無任何抽搐發(fā)作跡象。造模時模型組的38只大鼠在注射皮羅卡品后5min左右開始出現(xiàn)動作僵硬及刻板等,10min左右出現(xiàn)“洗臉”、點頭、“濕狗樣”抖動等面部動作,15～20min逐漸出現(xiàn)直立、跌倒、豎尾,甚至跳躍,發(fā)作逐漸由上肢延及下肢,以至于全身的強直陣攣發(fā)作,最終在30min左右導致SE產(chǎn)生。另有流涎、流淚、結膜充血、大汗、瞳孔縮小、腹瀉等外周膽堿能興奮表現(xiàn),4～7天后所有入組未死亡大鼠均出現(xiàn)自發(fā)性癲發(fā)作。SE后l小時,所有致癇大鼠均給予腹腔注射地西泮10mg/kg,其中25只終止SE,余致癇大鼠30min后再次給予腹腔注射地西泮10mg/kg,仍有2只未終止SE并于第二個30min內(nèi)死亡。2.模型大鼠沙棘波的發(fā)放生理鹽水對照組為正常EEG,頻率為16.25～27.86Hz,波幅15.3～50μV,無性波發(fā)放。造模時注射皮羅卡品后,癥狀未出現(xiàn)SE或評分未達RacineⅣ～Ⅴ級的大鼠EEG也無性波發(fā)放,但腦電波普遍慢化,波幅增高。模型組大鼠棘波發(fā)放在SE后25.64±9.07min左右出現(xiàn),最大頻率28Hz,最高波幅150μV;SE停止后,EEG的高頻率、高波幅棘波仍可持續(xù)8.54±0.68h左右,點燃SE后的第1、3天EEG未發(fā)現(xiàn)癇性波,但背景波頻率變慢,第1天的波幅較高,第7天后EEG監(jiān)測均出現(xiàn)周期性樣放電。3.周1月至5月se期①SE期0～6小時期間內(nèi)死亡6只;7～12小時期間內(nèi)死亡3只;13～24小時期間內(nèi)死亡1只。SE期死亡率為21.74%(10/46)。②靜默期第2天及第4天分別死亡1只。靜默期死亡率為4.35%(2/46)。③慢性期無致癇大鼠死亡?？偹劳雎蕿?6.09%(12/46)。4.腦表面明顯,腦切實有張力癲癇模型組SE期致癇大鼠死亡后立即行顱腦及肺部解剖。大鼠顱腦解剖見腦脊液明顯減少,全腦組織腫脹,以前腦明顯,腦表面為灰白色,腦切面濕潤質(zhì)軟。腦組織切片光鏡下所見腦血管擴張充血及輕-中度的腦水腫。肺部解剖見氣管大量分泌物,胸腔積血積液,肺組織肉眼可見肺表面濕潤,有散在出血點。病理切片見肺間質(zhì)毛細血管擴張、充血,肺間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)可見含蛋白液體滲出,提示肺水腫。氯化鋰-匹羅卡品致癇模型的合成鋰-匹羅卡品大鼠模型是Honchar等1983年在Science雜志上首次報道,此模型致癇鼠可出現(xiàn)SRS,且可導致海馬結構易損區(qū)的特異性損傷,被認為是具有與人類顳葉癲癇相似特征的致癇鼠模型,該模型使用匹羅卡品的量較大劑量匹羅卡品模型用量大大減少,降低了匹羅卡品的毒副作用所造成的高死亡率,同時增加了SE的誘發(fā)率,是近年來國外應用較多的一種公認的邊緣系統(tǒng)癲癇模型。鋰-匹羅卡品致癇模型的機制尚不十分清楚。Cavalheiro認為氯化鋰和匹羅卡品所致癲癇模型中,神經(jīng)元損傷部位主要位于前腦,包括海馬、齒狀回、梨狀皮層等區(qū);而在丘腦、嗅結節(jié)、新皮層、黑質(zhì)、杏仁核等處也可觀察到有神經(jīng)細胞的缺失。匹羅卡品是乙酰膽堿M受體激動劑,乙酰膽堿是腦內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),引起持續(xù)性的全身強直-陣攣發(fā)作。Voutsinos-Porche等認為氯化鋰的作用機制是通過抑制肌醇單磷酸酶,導致循環(huán)降解產(chǎn)物第二信使IP3和DG可利用度降低及腦內(nèi)肌醇水平,與匹羅卡品有協(xié)同作用,預先應用氯化鋰注射,可降低匹羅卡品誘發(fā)癇性發(fā)作的閾值而減少匹羅卡品劑量進而減少其毒副作用,降低致癇動物的死亡率。本研究在氯化鋰-匹羅卡品顳葉癲癇模型的基礎上對匹羅卡品的用法及致癇大鼠SE后的對癥處理做了一些改進,匹羅卡品30min后如無Ⅳ以上癇性發(fā)作,繼續(xù)給予10mgPkg匹羅卡品注射,每隔30min追加一次,自到出現(xiàn)SE為止。為保證實驗條件的均一性,每只大鼠總量不超過50mgPkg。在配置配置匹羅卡品溶液發(fā)現(xiàn)配置匹羅卡品的濃度不能過低,若濃度過低會導致匹羅卡品劑量增加,可能是由于短時間不能達到較高的血藥濃度而不能發(fā)揮其致SE的作用。SE肢體劇烈抽搐造成能量及體液消耗,以及外周膽堿能受體M樣作用所致的消化液和汗液過量分泌,使大鼠極易休克,出現(xiàn)對外界無反應狀態(tài),絕食水,因而SE期后毒性階段致癇鼠死亡多因營養(yǎng)耗竭。因而本研究在SE后1周給予腹腔注射糖鹽加強營養(yǎng),與文獻報道相比,以上改進既增加了SE誘發(fā)率又降低了死亡率。在本組實驗中,注射氯化鋰-匹羅卡品后,癲癇模型組點燃最后出現(xiàn)RacineⅣ級以上者46只(92%),癲癇模型點燃后總死亡率為26.09%(12/46),其中SE期死亡率為21.74%(10/46)。說明鋰-匹羅卡品顳葉癲癇模型致癇成功率高,致癇后總體死亡率不高,且主要集中于SE期。分析原因:①腹腔注射匹羅卡品前30min給予硫酸阿托品1mg/kg腹腔注射,雖然能有效地減輕匹羅卡品本身導致的外周膽堿能效應,對減少腺體分泌,緩解支氣管痙攣,改善呼吸極為重要。然而雖然地西泮靜脈注射是臨床搶救癲癇現(xiàn)場發(fā)作的首選藥物,而在本模型抗癲癇作用并不理想,第一次腹腔注射后終止SE率僅為54.35%(25/46),追加劑量后仍有2只致癇大鼠未能終止SE并于第二個30分鐘內(nèi)死亡。就其原因除與在本模型中,地西泮采用腹腔注射,導致油劑吸收緩慢而不規(guī)則外,地西泮可能使大鼠吞咽、嗆咳反射減弱或消失,呼吸道分泌增多,加重匹羅卡品本身導致的膽堿能效應,使支氣管痙攣和腺體分泌增加,氣道阻塞進一步加重,引起肺水腫,進而導致腦缺血缺氧,引起全腦水腫,導致致癇大鼠死亡。死亡大鼠經(jīng)解剖證實均存在急性肺水腫及腦水腫即是最好證明。②本研究在SE后1周給予腹腔注射糖鹽加強營養(yǎng),有效地減輕毒性階段因厭倦不動、不進食物及飲水、體重減輕、脫水等導