谷氨酸在戊四唑化學(xué)點(diǎn)火癲癇模型中的作用

谷氨酸在戊四唑化學(xué)點(diǎn)火癲癇模型中的作用

癲癇是一種常見的慢性臨床綜合征，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜。目前,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)平衡失調(diào)所致。谷氨酸(Glutamate,Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì),其含量的增多起著決定性的作用。但其含量是如何增加,以及增加以后是怎樣引起癲癇發(fā)作的機(jī)制仍然不是很清楚。因此,本實(shí)驗(yàn)在采用戊四唑化學(xué)點(diǎn)燃模型的基礎(chǔ)上,按不同發(fā)作級(jí)別,通過(guò)免疫組織化學(xué)方法和圖象分析技術(shù),來(lái)觀察癲癇模型大鼠腦內(nèi)Glu表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化,旨在進(jìn)一步揭示其在癲癇發(fā)病中的作用。1材料和方法1.1亞驚厥racine評(píng)分健康成年雄性Wistar大鼠30只,體重200~220g,實(shí)驗(yàn)前在安靜環(huán)境下飼養(yǎng)24h以上。隨機(jī)分為2組:對(duì)照組6只和模型組24只。模型組按點(diǎn)燃不同進(jìn)程又分為4組:Ⅰ級(jí)發(fā)作組(Ⅰ級(jí)組)、Ⅲ級(jí)發(fā)作組(Ⅲ級(jí)組)、Ⅴ級(jí)發(fā)作組(Ⅴ級(jí)組)和Ⅴ級(jí)發(fā)作后間歇24h組(Ⅴ級(jí)/24h組),每組各6只。各組大鼠分別于癲癇發(fā)作I級(jí)、Ⅲ級(jí)、V級(jí)和V級(jí)后24h灌注取材。安靜室內(nèi),將大鼠放在有機(jī)塑料箱內(nèi)(20cm×50cm×20cm)。每隔日腹腔注射一次閾下劑量的戊四唑35mg/kg(pentylenetetrazol,PTZSigma公司產(chǎn)品)即亞驚厥劑量。每48h一次,連續(xù)給藥13次,每次觀察1h。每次注射均在早上8:00~10:00進(jìn)行,同時(shí)觀察大鼠行為變化。行為驚厥評(píng)分采用Racine評(píng)分法,即0級(jí):未發(fā)作;Ⅰ級(jí):頭面部抽搐;Ⅱ級(jí):肌陣攣、跳起,但無(wú)直立;Ⅲ級(jí):肌陣攣,雙前肢抬起伴有直立;Ⅳ級(jí):強(qiáng)直-陣攣性驚厥;Ⅴ級(jí):全身強(qiáng)直-陣攣性驚厥伴有翻滾、跌倒。凡獲連續(xù)至少3次Ⅳ或Ⅴ級(jí)發(fā)作的大鼠,被認(rèn)為是完全點(diǎn)燃。1.2glu免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元的檢測(cè)取實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織,常規(guī)石蠟包埋,Leitz切片機(jī)切片,片厚5μm,行免疫組織化學(xué)染色。實(shí)驗(yàn)步驟如下:組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟,梯度酒精下行,并水化到0.01mol/LPBS緩沖液中;微波爐抗原修復(fù)15min;0.3%TritonX-10030℃孵育30min;滴加A液過(guò)氧化酶阻斷劑,30℃孵育10min;滴加B液,30℃孵育10min,0.01MPBS(pH7.4)浸潤(rùn);滴加一抗(兔抗Glu多克隆抗體,美國(guó)Sigma公司<日本劉繼光博士惠贈(zèng)>),4℃冰箱內(nèi)孵育48h;滴加C液,30℃孵育30min;滴加D液,30℃孵育30min;DAB呈色反應(yīng),在光鏡下控制顯色3~5min;上述各步驟間均采用PBS充分洗滌。梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。替代實(shí)驗(yàn),用PBS代替一抗,余同。未見Glu免疫表達(dá)陽(yáng)性。參照PaxinosandWatson所著的大鼠腦立體定位圖譜,在Olympus顯微鏡下,將Glu免疫組織化學(xué)染色切片與相鄰的Nissl染色切片比較進(jìn)行定位,觀察大鼠海馬結(jié)構(gòu)齒狀回(DG)和海馬回CA3區(qū)及大腦顳葉皮質(zhì)(TC)內(nèi)Glu免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元的形態(tài)及其分布。每例取6張Glu染色切片,在顯微鏡下觀察,用顯微鏡目測(cè)器對(duì)大鼠海馬DG、CA3及大腦TC內(nèi)Glu免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元進(jìn)行數(shù)目測(cè)定,測(cè)量窗面積為16900μm2。每張切片各部位均隨機(jī)觀察3個(gè)視野,取其平均值。采用Tiger圖象分析儀測(cè)定海馬DG、CA3和大腦TC的免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元的平均光密度(AOD)值,每只大鼠各選6張切片,每張切片的每個(gè)測(cè)定部位隨機(jī)選3個(gè)視野,取平均值。所有AOD值測(cè)量均在相同的光學(xué)條件下完成。1.3酒精密度、酒精用量石蠟切片常規(guī)脫蠟,梯度酒精,水化;入0.1%焦油紫37℃10min;蒸餾水洗;70%酒精、95%酒精、100%酒精各3次,每次1min;二甲苯透明,中性樹膠封片。結(jié)果用SPSS10.0forwindows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用xˉ±sxˉ±s表示,作單因素方差分析,進(jìn)行組間的兩兩比較,以α=0.05為顯著性水準(zhǔn),判斷各組之間的差異是否具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1肢體肌注及流瞳在PTZ連續(xù)注射過(guò)程中,大鼠逐漸出現(xiàn)凝視、點(diǎn)頭、面部及頭部抽搐、全身肌陣攣、雙前肢抬起、最終發(fā)生全身性強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作伴有跌倒及流涎。PTZ完全點(diǎn)燃的大鼠,有自始自終的發(fā)作過(guò)程,其驚厥等級(jí)分明,全身強(qiáng)直-陣攣性驚厥十分明顯。2.2glu-ir陽(yáng)性大鼠腦區(qū)免疫反應(yīng)鏡下可見,對(duì)照組大鼠Glu免疫反應(yīng)(Glu-IR)陽(yáng)性神經(jīng)元主要分布在DG的顆粒細(xì)胞層和海馬回的錐體細(xì)胞層及大腦皮質(zhì)各層。陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿呈均勻棕黃色,胞核未著色。模型組大鼠各部位的Glu-IR陽(yáng)性較對(duì)照組大鼠相應(yīng)腦區(qū)的免疫反應(yīng)陽(yáng)性增強(qiáng),細(xì)胞數(shù)目增加,排列緊密,形態(tài)多以圓形和橢圓形為主(圖1、圖2和圖3)。戊四唑點(diǎn)燃癲癇大鼠,Ⅲ級(jí)組和Ⅴ級(jí)組與對(duì)照組相比,DG、CA3和TC的Glu-IR陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目和AOD值顯著性增加(P<0.05或P<0.01);Ⅴ級(jí)組與Ⅲ級(jí)組相比,相應(yīng)部位Glu-IR陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目減少和AOD值下降,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);I級(jí)組和Ⅴ級(jí)/24h組與對(duì)照組相比,相應(yīng)部位Glu-IR陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目和AOD值差別無(wú)顯著性(P>0.05,表1、表2)。3討論3.1戊四唑化學(xué)點(diǎn)燃模型點(diǎn)燃目前被公認(rèn)為是一種理想的癲癇動(dòng)物模型,其致癇性增高具有永久的保留能力,并較好地模擬了人類癲癇的進(jìn)行性發(fā)展和長(zhǎng)期反復(fù)的自限性發(fā)作形式。戊四唑是一種常用的化學(xué)致癇劑,本實(shí)驗(yàn)采用的戊四唑化學(xué)點(diǎn)燃模型是一種全身發(fā)作性癲癇模型,較成功地復(fù)制出了接近人類癲癇的慢性癲癇模型。此模型具有以下優(yōu)點(diǎn):①制作方便,成功率高;②不受麻醉劑和手術(shù)過(guò)程的影響,便于全面觀察動(dòng)物驚厥發(fā)作;③所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單,容易推廣;④不破壞局部腦組織的結(jié)構(gòu),不伴有神經(jīng)元損傷、壞死,有利于進(jìn)一步開展腦組織各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè),尤其適用于癲癇腦組織形態(tài)學(xué)的觀察。3.2glu在癲癇發(fā)病過(guò)程中的作用Glu作為腦內(nèi)的一種興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì),其興奮性增強(qiáng)在癲癇的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。其含量的增加、代謝的變化、受體密度的增加及結(jié)合位點(diǎn)的增多等都可以引起其作為一種神經(jīng)遞質(zhì)興奮性的變化。其中其含量的增加是一種始動(dòng)因素。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),戊四唑點(diǎn)燃癲癇大鼠,Ⅲ級(jí)組和Ⅴ級(jí)組與對(duì)照組相比,海馬DG、CA3區(qū)谷氨酸免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目和AOD值均有明顯增加。與以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符,并以不同的癲癇模型進(jìn)一步驗(yàn)證了Glu在癲癇發(fā)病中起作用。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)對(duì)戊四唑化學(xué)點(diǎn)燃進(jìn)程中Glu的含量變化作一動(dòng)態(tài)觀察,發(fā)現(xiàn)點(diǎn)燃過(guò)程中,隨著點(diǎn)燃的發(fā)展,Glu的含量變化是呈先增加后減少的趨勢(shì)。其中Ⅲ級(jí)發(fā)作組,Glu-IR陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目和AOD值最高,Ⅴ級(jí)發(fā)作組(完全點(diǎn)燃組)有所下降。Ⅴ級(jí)/24h組,基本恢復(fù)到對(duì)照組水平。有文獻(xiàn)報(bào)道,在海馬雙側(cè)緩慢置入普通電極和微透析電級(jí),腦電圖觀察發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作產(chǎn)生前在發(fā)作側(cè)局部病灶就有胞外Glu顯著增高。體外微透析測(cè)定也發(fā)現(xiàn),癲癇發(fā)作引起谷氨酸釋放加倍,而清除減少。胞外谷氨酸的釋放增加與癲癇發(fā)作密切相關(guān)。因此,本人推測(cè)可能正是由于在完全點(diǎn)燃時(shí),細(xì)胞內(nèi)Glu大量釋放,細(xì)胞外Glu含量相應(yīng)增加,細(xì)胞內(nèi)Glu含量則由于大量釋放而減少,而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)含量減少到一定程度時(shí),Glu陽(yáng)性細(xì)胞則轉(zhuǎn)為陰性,從而會(huì)出現(xiàn)Ⅴ級(jí)發(fā)作組Glu