枸杞多糖對淋巴細(xì)胞功能的影響

枸杞多糖對淋巴細(xì)胞功能的影響腫瘤患者在接受放射線和化療藥物治療時,射線和藥物對機(jī)體的免疫系統(tǒng)有抑制作用,致使機(jī)體的免疫功能進(jìn)一步下降,影響了治療效果,并可導(dǎo)致一些不良反應(yīng)。同時研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者免疫功能下降常伴隨一些細(xì)胞因子水平的變化,如IL-2、IL-12、IFN、TNF等[4]。所以,解決腫瘤患者免疫功能低下問題成為治療腫瘤非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。

最近,國內(nèi)外學(xué)者提出生物反應(yīng)調(diào)節(jié)(BRM)的概念,強(qiáng)調(diào)在腫瘤放化療及手術(shù)治療的同時應(yīng)用BRM不但能提高患者的免疫功能,還可減輕上述治療對免疫系統(tǒng)及造血系統(tǒng)的損害,從而提高治療效果。在我國,中藥取自天然,來源廣泛,容易獲得,不良反應(yīng)小。為此,本實驗試圖對枸杞多糖免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行研究,研究其對外周血淋巴細(xì)胞增殖及功能的影響。摘要為研究枸杞多糖(LBP)對正常人外周血淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響，通過無菌分離人外周血淋巴細(xì)胞,加入植物凝集素(PHA)和不同質(zhì)量濃度LBP,MTT法檢測其對淋巴細(xì)胞增殖的影響;ELISA法檢測LBP作用后淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá)情況，來研究枸杞多糖對外周血淋巴細(xì)胞增殖及功能的影響。關(guān)鍵詞枸杞多糖;外周血;淋巴細(xì)胞;增殖;抗腫瘤;免疫功能一.實驗原理枸杞多糖(LBP)是傳統(tǒng)中藥材枸杞的主要成分之一,由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6種單糖組成。而實驗證明多糖成分(如云菇多糖、靈芝多糖等)可通過激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)來達(dá)到抗腫瘤的目的[1-2],目前對于枸杞多糖抑制腫瘤的免疫調(diào)節(jié)作用及免疫機(jī)制尚不十分清楚。PHA是T細(xì)胞非特異性有絲分裂原,能與T細(xì)胞表面CD3/TCR復(fù)合體結(jié)合,導(dǎo)致包括CD3+、CD4+、CD8+以及LAF-1等細(xì)胞表面分子磷酸化,通過激活PKC途徑引起細(xì)胞活化。TNF-α能夠直接殺死病毒和腫瘤,在CD8+T的成熟階段發(fā)揮著重要的信號作用,TNF-α缺乏時會導(dǎo)致效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生下降,影響其轉(zhuǎn)化為記憶性T細(xì)胞?？梢?TNF-α除了對腫瘤細(xì)胞具有直接毒性和生長抑制作用外,還可以通過增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用抵抗腫瘤的生長。本實驗主要是以枸杞多糖為材料來研究其對人外周血淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用,為進(jìn)一步開發(fā)增強(qiáng)免疫力的抗腫瘤藥物提供參考。二、實驗材料與分組

1.材料健康人外周血采自20～30歲健康志愿者。枸杞多糖由本校實驗中心從優(yōu)質(zhì)枸杞子中分離提取,純度為99%。RPMI-1640為Gibco公司產(chǎn)品。植物凝集素（PHA)、MTT試劑均為Sigma公司產(chǎn)品。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、ELISA試劑盒購自晶美生物工程有限公司。淋巴細(xì)胞分離液為上海生化試劑二廠產(chǎn)品。胎牛血清(FBS)為杭州四季青公司產(chǎn)品。2.

分組據(jù)實驗孔中加入枸杞多糖質(zhì)量濃度的不同以及加入或不加PHA將實驗分為對照組、PHA組、枸杞多糖組、PHA＋枸杞多糖組。三、實驗方法1.

人外周血淋巴細(xì)胞的分離和增殖反應(yīng)取健康人外周血約5mL,肝素抗凝,加入等體積PBS混勻,用淋巴細(xì)胞分離液經(jīng)密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)取白細(xì)胞層用PBS洗滌2次,加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。未貼壁細(xì)胞為淋巴細(xì)胞,將其重懸于培養(yǎng)液中,2%臺盼藍(lán)試驗證實細(xì)胞存活率>95%,調(diào)整濃度為2×109L-1。加入96孔板中,每孔100μL,實驗孔加入不同質(zhì)量濃度的枸杞多糖,加入或不加PHA,枸杞多糖終質(zhì)量濃度分別為100,80,60,50μg/L,每組均設(shè)4個復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)72h,各孔加入MTT(5g/L)20μL,培養(yǎng)過夜,離心棄去培養(yǎng)上清,每孔加入DMSO150μL,混勻后以測定波長570nm、參考波長620nm檢測各孔吸光度(A)值,并計算增殖指數(shù)。增殖指數(shù)=實驗組A值/對照組A值×100%。將所測及計算結(jié)果記錄于表一。

表一各組外周血淋巴細(xì)胞增殖情況比較（x±s,n=4）

組別濃度/（㎎/L）A值增值指數(shù)對照組－PHA組0.050枸杞多糖組506080100PHA＋枸杞多糖組50+0.050