基因工程原理復(fù)習(xí)重點(diǎn)

基因工程原理復(fù)習(xí)重點(diǎn)基因家族(Genefamily)又叫多基因家族(Multigenefamily)，系指同一生物體中，從同一祖先基因經(jīng)過(guò)復(fù)制、突變而來(lái)的一組具有相似的核苷酸序列結(jié)構(gòu)、相似產(chǎn)物、相似功能的基因群體。從廣義上講，同一基因家族的各個(gè)成員也可看作是重復(fù)基因。但兩者相比，基因家族不同成員之間的序列差異畢竟要比重復(fù)序列的大一些，也就是說(shuō)序列一致性程度還是較低一些?；虼?Genecluster)系指原核生物基因組中，由不同的或相關(guān)的一組相鄰基因組成的一種特殊的排列組合方式?；蚣易迮c基因簇二者的區(qū)別屬于同一多基因家族的各個(gè)成員，可以存在于不同的染色體上，也可以是存在于同一條染色體上。同一基因家族成員的判斷標(biāo)準(zhǔn)：a.多重性；b.緊密的連鎖性；c.核苷酸序列同源性；d.相關(guān)的表型與功能?；虼氐奶攸c(diǎn)：同一基因簇的不同成員，在遺傳上往往是緊密連鎖的；同一基因簇的不同成員，可以是同屬于同一個(gè)操縱子的不同結(jié)構(gòu)基因，也可以是屬于不同操縱子的不同結(jié)構(gòu)基因。同一基因簇的不同成員，可以是來(lái)自同一基因家族的不同成員，也可以是來(lái)自不同基因家族的不同成員?；驁D(Genemap):是描述染色體或DNA大分子上，不同基因的排列順序及其間隔距離的一種線性圖。基因作圖(Genemapping):按照遺傳學(xué)的方法或者是物理學(xué)的方法繪制基因圖的過(guò)程，叫做基因作圖?；蜃鲌D有時(shí)也叫做基因定位。它涉及如下兩個(gè)具體的內(nèi)容：丹.其一是確定被研究的目的基因與細(xì)胞染色體之間的關(guān)系，也就是說(shuō)將目的基因定位在某條特定的染色體分子上。^其二是測(cè)定目的基因與所在染色體的其它基因之間的間隔距離，以及它們之間的線性排列順序，亦即是確定目的基因在染色體上的位置?；驁D包括遺傳圖和物理圖兩種。兩者之間的本質(zhì)差別在于前者表示的是以重組率為單位的基因間的相對(duì)距離，而后者表示的是以堿基對(duì)(bp)為單位的基因間的實(shí)際距離?；蛟黾?Geneaddition):與基因擴(kuò)增概念不同，它是通過(guò)將一種或一群外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，從而使受體細(xì)胞中基因種類增加，用以觀察并研究其功能作用的一種基因工程策略?；驍U(kuò)增(Geneamplification):特指基因拷貝數(shù)增加的過(guò)程，包括如下5種不同情況：①在體外，應(yīng)用PCR技術(shù)和適當(dāng)?shù)囊铮墒固囟ɑ虻目截悢?shù)得到成功的擴(kuò)增。②克隆，將基因插入到高拷貝數(shù)的質(zhì)粒分子上，于是在體內(nèi)情況下該基因的拷貝數(shù)也變的相應(yīng)富裕起來(lái)。③一些外界環(huán)境的壓力因素可以使真核細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)，從而導(dǎo)致相應(yīng)的保衛(wèi)基因發(fā)生明顯擴(kuò)增。例如，高劑量的氨甲喋吟可導(dǎo)致二氨葉酸還原酶基因發(fā)生擴(kuò)增。④程序基因擴(kuò)增。包括全基因組擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增兩種模式。前者是指通過(guò)增加細(xì)胞基因組的拷貝數(shù)，而使特定基因的拷貝數(shù)得以增加；后者是指因特定發(fā)育需要而偶爾增加對(duì)其產(chǎn)物需求量高的基因的拷貝數(shù)。例如，非洲爪蟾在發(fā)育過(guò)程中rRNA基因的擴(kuò)增。⑤進(jìn)化擴(kuò)增，在生物進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生基因加倍和擴(kuò)增，結(jié)果使相關(guān)的基因在基因組上聚集成簇。5'-側(cè)翼序列區(qū)和3'-側(cè)翼序列區(qū)5'-側(cè)翼序列區(qū)(5'-flankingsequenceregion)位于mRNA轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)之前的一段長(zhǎng)度有限的DNA序列區(qū)，叫做5'-側(cè)翼序列區(qū)，或者泛稱為啟動(dòng)子區(qū)。在該區(qū)存在著數(shù)種控制基因轉(zhuǎn)錄的信號(hào)：確定mRNA起點(diǎn)的信號(hào)決定最大轉(zhuǎn)錄起始速率的信號(hào)對(duì)環(huán)境刺激作出反應(yīng)的信號(hào)對(duì)發(fā)育程序作出反應(yīng)的信號(hào)增強(qiáng)子序列區(qū)3'-側(cè)翼序列區(qū)(3'-flankingsequenceregion)位于mRNA轉(zhuǎn)錄終點(diǎn)之后的一段長(zhǎng)度有限的DNA序列區(qū)，叫做3'-側(cè)翼序列區(qū)，也叫做3'-下游序列區(qū)。在該區(qū)存在著數(shù)種控制基因轉(zhuǎn)錄的信號(hào)：終止轉(zhuǎn)錄作用的信號(hào)mRNA3'-末端的加工信號(hào)大多數(shù)真核基因的3'-末端還有一段poly(A)加尾信號(hào)，即多聚腺苷酸化信號(hào)前導(dǎo)序列區(qū)和尾隨序列區(qū)前導(dǎo)序列區(qū)(leadersequenceregion)指位于mRNA5'-末端，起始密碼子之前的一段長(zhǎng)達(dá)數(shù)百個(gè)核苷酸的不轉(zhuǎn)譯的RNA區(qū)段，也叫前導(dǎo)序列或5'-非轉(zhuǎn)譯區(qū)，簡(jiǎn)稱5'-UTR。它含有如下兩種元件：核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Ribosome-bindingsite,RBS)轉(zhuǎn)譯起始信號(hào)尾隨序列區(qū)(trailersequenceregion)指位于mRNA3'-末端，終止密碼子之后的一段非轉(zhuǎn)譯的核苷酸序列，叫做尾隨序列區(qū)，也叫做尾隨序列或3'-非轉(zhuǎn)譯區(qū)，簡(jiǎn)稱3'-UTR，其長(zhǎng)度約為100個(gè)核苷酸左右，它含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。真核基因和原核基因真核基因：真核細(xì)胞核基因組DNA編碼的基因，以及感染真核細(xì)胞的DNA病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒基因組編碼基因，統(tǒng)稱真核基因。原核基因：由原核生物染色體基因組DNA以及高等生物線粒體基因組DNA和葉綠體基因組DNA編碼的基因，都屬于原核基因。真核基因與原核基因的共有組成部分無(wú)論真核基因還是原核基因，其結(jié)構(gòu)都有如下4個(gè)部分：編碼區(qū)(codingregion)非編碼區(qū)(noncodingregion)啟動(dòng)區(qū)（promoterregion）終止區(qū)（terminatorregion）編碼區(qū)（1） 編碼區(qū)的含義：在原核蛋白質(zhì)編碼基因的mRNA分子中，以及在真核蛋白質(zhì)編碼基因的成熟mRNA分子中，從起始密碼子（通常是AUG）開(kāi)始至終止密碼子（UAA,UAG,UGA）為止的一段編碼氨基酸的核苷酸序列，叫做編碼區(qū)，或稱編碼序列區(qū)。（2） 不連續(xù)的編碼序列區(qū)：真核基因結(jié)構(gòu)的主要特征是，許多真核蛋白質(zhì)編碼基因以及某些tRNA基因，它們的轉(zhuǎn)錄序列區(qū)都是被一種叫做間隔子（intron）的非編碼序列所間斷，形成不連續(xù)的編碼序列區(qū)。（3） 編碼區(qū)段與讀碼框：編碼區(qū)與開(kāi)放讀碼框（openreadingfram）在概念上是有差別的。開(kāi)放讀碼框（ORF）也有的叫可讀框，是指由一系列氨基酸密碼子組成的不具有終止密碼子的DNA序列區(qū)，或者說(shuō)是可以轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)多肽鏈的一段DNA序列區(qū)。它與編碼區(qū)的差別在于它不包括終止密碼子，而編碼區(qū)則包括終止密碼子。非編碼區(qū)（1） 非編碼區(qū)的定義：基因中轉(zhuǎn)錄而不轉(zhuǎn)譯的核苷酸序列區(qū)。盡管這些非編碼序列區(qū)不轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)多肽鏈產(chǎn)物，但對(duì)基因的表達(dá)與調(diào)控卻是必不可少的。（2） 非編碼區(qū)的類型5'-末端非轉(zhuǎn)譯區(qū)（5'-UTR）3'-末端非轉(zhuǎn)譯區(qū)（3'-UTR）間隔子序列區(qū)（真核蛋白質(zhì)編碼基因中存在）啟動(dòng)區(qū)（啟動(dòng)子）（1）啟動(dòng)區(qū)的定義：相應(yīng)于原核的啟動(dòng)區(qū)（promoter）在真核基因中則往往譯作啟動(dòng)子，特指位于基因5'-末端上游緊鄰轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)外側(cè)，一段具有特殊功能的非編碼的核苷酸序列區(qū)。在有關(guān)的文獻(xiàn)中，啟動(dòng)區(qū)的定義似乎不那么嚴(yán)格，有時(shí)人們也把5'-側(cè)翼序列區(qū)泛稱為啟動(dòng)區(qū)。從廣義的角度講，控制基因轉(zhuǎn)錄的各種信號(hào)的任何組合都可以稱之為啟動(dòng)區(qū)。例如有人也把增強(qiáng)子(enhancer)歸為真核基因啟動(dòng)子的一個(gè)組成元件.啟動(dòng)區(qū)的結(jié)構(gòu)原核基因啟動(dòng)區(qū)的結(jié)構(gòu)：-10元件，亦叫-10box或Pribnowbox，也可稱之為T(mén)ATAATbox;-35元件，也叫做-35box，或TTGACAbox。真核基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)：-25元件，亦叫TATA盒；上游激活元件：GCbox和CAATbox。啟動(dòng)區(qū)的類型：根據(jù)識(shí)別啟動(dòng)子的RNA聚合酶的類別，可將真核啟動(dòng)子分成三種不同的類型：a.I型啟動(dòng)子b.n型啟動(dòng)子c.m型啟動(dòng)子終止區(qū)終止區(qū)的定義：(terminatorregion)也叫做終止序列，—般特指位于原核生物操縱子3'-末端，也是轉(zhuǎn)錄單位3'-末端轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)之后的一段DNA序列，其功能是為RNA聚合酶提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。終止子(terminator)，也叫做轉(zhuǎn)錄終止子或終止序列，是指位于真核基因3'-末端下游外側(cè)與轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)相連的一段非編碼的核苷酸序列區(qū)。它具有使RNA轉(zhuǎn)錄反應(yīng)終止的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的功能。終止區(qū)的意義(功能)：保證基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在正確的位置終止；產(chǎn)生正確長(zhǎng)度的mRNA分子；產(chǎn)生正確的蛋白質(zhì)多肽鏈；避免產(chǎn)生通讀現(xiàn)象。原核基因組的結(jié)構(gòu)大腸桿菌基因組的組成：染色體基因組；質(zhì)粒基因組；噬菌體基因組。（2）大腸桿菌基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（有4點(diǎn)）:*1.高效的遺傳信息利用率既沒(méi)有不必要的額外重復(fù)序列，也極少存在無(wú)功能的冗余序列；基因組98%以上的核苷酸序列都是編碼基因基因排列緊湊，同一個(gè)操縱子不同基因之間的間隔距離一般不超過(guò)20bp，而且其中還存在著轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)和終止信號(hào)；存在著編碼序列彼此重疊、編碼不同蛋白質(zhì)的重疊基因*2.雙鏈DNA的編碼功能關(guān)于正義鏈和反義鏈的劃分，文獻(xiàn)中有兩種不同的意見(jiàn)：早期文獻(xiàn)：轉(zhuǎn)錄RNA轉(zhuǎn)錄本的模板鏈，叫做正義鏈，也叫做有義鏈或編碼鏈，簡(jiǎn)稱（+）鏈。與正義鏈互補(bǔ)的DNA鏈，叫做反義鏈，也叫無(wú)義鏈或非編碼鏈，簡(jiǎn)稱（-）鏈。現(xiàn)在的文獻(xiàn)：雙鏈DNA分子中轉(zhuǎn)錄RNA轉(zhuǎn)錄本的模板鏈，叫做反義鏈或非編碼鏈，簡(jiǎn)稱（-）鏈。雙鏈DNA分子中模板鏈的互補(bǔ)鏈，叫做編碼鏈，又叫正義鏈，簡(jiǎn)稱（+）鏈。除了以。取代T之外，它與RNA轉(zhuǎn)錄本具有同樣的核苷酸序列結(jié)構(gòu)。E.coli基因的編碼序列，并非都是位于基因組DNA中某一條固定的單鏈上。也就是說(shuō)基因組DNA的兩條鏈，并沒(méi)有規(guī)定哪一條是正義鏈，哪一條是反義鏈。而是在雙鏈DNA（基因組）的任何一條單鏈中，都同時(shí)存在著正義鏈和反義鏈。對(duì)基因組是如此，但對(duì)單個(gè)基因則不然。*3.多基因聚集排列的操縱子結(jié)構(gòu)形式大腸桿菌基因組結(jié)構(gòu)的另一個(gè)特點(diǎn)是，若干功能相關(guān)的基因往往聚集在一起形成獨(dú)立的操縱子結(jié)構(gòu)。操縱子的一般結(jié)構(gòu)：a.—個(gè)或數(shù)個(gè)調(diào)節(jié)基因b.若干個(gè)結(jié)構(gòu)基因，小的操縱子只有三個(gè)基因。大的操縱子有11個(gè)結(jié)構(gòu)基因。c.上游控制單元，包括操縱單元和啟動(dòng)區(qū)。*4.染色體基因組的拷貝數(shù)大腸桿菌染色體基因組的拷貝數(shù)，也就是說(shuō)究竟一個(gè)細(xì)胞同時(shí)能擁有幾條染色體。這是依細(xì)菌的生長(zhǎng)條件而定：在營(yíng)養(yǎng)富裕的培養(yǎng)基中，每個(gè)細(xì)胞可同時(shí)擁有3?4條染色體分子。在碳源供應(yīng)不足的培養(yǎng)基中，平均每個(gè)細(xì)胞只擁有1.1條染色體原核基因的結(jié)構(gòu)：*1.原核基因DNA序列的結(jié)構(gòu)：?jiǎn)?dòng)區(qū)序列；轉(zhuǎn)錄序列區(qū)：(5'-UTR;cDNA序列區(qū)-編碼區(qū)；3’-UTR);:終止序列區(qū)*2.原核基因mRNA的結(jié)構(gòu)：(a)啟動(dòng)區(qū)(b)轉(zhuǎn)錄序列區(qū)：①5’-UTR②編碼區(qū)，包括起始密碼子和終止密碼子；③3’-UTR(c)終止區(qū)真核基因的特點(diǎn)：(1)與原核基因不同，真核基因往往含有內(nèi)含子(intron)，它是被包圍在編碼區(qū)之中的非編碼序列；真核基因是單順?lè)醋?，編碼單基因產(chǎn)物，而原核基因則往往組成大的轉(zhuǎn)錄單位多順?lè)醋?，即單一的mRNA分子可編碼多種基因產(chǎn)物；(3)成熟的蛋白質(zhì)基因的mRNA分子的5’-端有一個(gè)帽的結(jié)構(gòu)，3’-端有一個(gè)Poly(A)尾巴。真核基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：*1.包裝成特定的染色體結(jié)構(gòu)；真核基因組DNA不是裸露的，而是被包裝成若干條甚至數(shù)十條不同的染色體，這是真核基因組的一大特點(diǎn)。*2.基因組的多倍性；大多數(shù)真核生物都是二倍體，具有兩套分別來(lái)自雙親的完整的基因組。而且有些高等植物還是多倍體，擁有多拷貝的基因組。*3.具有大量的重復(fù)序列；重復(fù)序列的類型：低度?，中度?，高度?重復(fù)序列的排列方式：①串聯(lián)重復(fù)排列②分散重復(fù)排列*4.高比例的非編碼的DNA序列；在真核生物基因組DNA中含有大量的非編碼的DNA序列，包括基因與基因之間的非編碼的DNA序列，以及基因內(nèi)部的非編碼的DNA序列。以人為例，非編碼序列占基因組總長(zhǎng)的98%以上，而蛋白質(zhì)編碼基因的序列還不到基因組總長(zhǎng)的2%。*5.龐大的基因數(shù)量；擬南芥25,000種左右，水稻40,000種左右，人類24,000個(gè)左右。16.隱蔽基因定義：位于基因組蛋白質(zhì)編碼基因之間的非編碼的DNA序列中，只編碼RNA不編碼蛋白質(zhì)的一類RNA基因，叫做隱蔽基因。斷裂基因：在轉(zhuǎn)錄區(qū)的核苷酸序列區(qū)中，插入有與氨基酸編碼無(wú)關(guān)的DNA間隔序列區(qū)，使一個(gè)基因的編碼序列分隔成若干個(gè)不連續(xù)區(qū)段的基因，叫做斷裂基因，包括內(nèi)含子（intron）和外顯子（exon）。真核基因的結(jié)構(gòu)（1）真核基因DNA序列水平的結(jié)構(gòu):a.啟動(dòng)子序列區(qū)b.轉(zhuǎn)錄序列區(qū)c.終止子序列區(qū)（2）真核基因pre-mRNA的結(jié)構(gòu)：a.5’-UTRb.外顯子仁內(nèi)含子3’-UTR序列（3）真核基因成熟mRNA的結(jié)構(gòu)（五部分）：真核蛋白質(zhì)mRNA前體（pre-mRNA）經(jīng)過(guò)剪輯加工（去掉間隔子、加帽和加尾）成熟后，被輸送到細(xì)胞質(zhì)。5’-帽的結(jié)構(gòu)5’-UTR序列編碼序列3’-UTR序列3’-端poly(A)尾巴增強(qiáng)子(enhancer)又叫做增強(qiáng)子元件或增強(qiáng)子序列，是真核基因中發(fā)現(xiàn)的一種特異序列，能夠在距離目標(biāo)基因50kb以上的位置，從上游或下游的不同位置及方向增強(qiáng)該基因的轉(zhuǎn)錄活性。一般是位于真核基因5’-側(cè)翼序列區(qū)，但也有的是位于轉(zhuǎn)錄區(qū)和3’-側(cè)翼序列區(qū)。增強(qiáng)子的功能作用：成環(huán)作用；增強(qiáng)子可影響模板附近的DNA超螺旋的密度(結(jié)構(gòu))，諸如導(dǎo)致DNA超螺旋彎曲，或是在反式作用因子參與下，以蛋白質(zhì)之間的相互作用為媒介，使增強(qiáng)子和啟動(dòng)子之間的DNA“成環(huán)”的連接模式起始轉(zhuǎn)錄。固定作用將模板固定在細(xì)胞內(nèi)特定位置，如連接在核基質(zhì)上，有利于拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)張力，有利于促進(jìn)RNA聚合酶在DNA鏈上的結(jié)合與滑動(dòng)。引導(dǎo)作用可以為反式因子或RNA聚合酶II提供進(jìn)入染色體結(jié)構(gòu)的“進(jìn)入位點(diǎn)”?；虻姆诸惏纯截悢?shù)分：?jiǎn)慰截惢?，多拷貝基因按產(chǎn)物類型分：結(jié)構(gòu)基因，調(diào)節(jié)基因⑶按表達(dá)特性分：組成基因，誘導(dǎo)基因按實(shí)驗(yàn)用途分：選擇基因，報(bào)告基因按排列組合特點(diǎn)分：基因家族，基因簇選擇基因：指可使被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞獲得其親本細(xì)胞所不具有的新的遺傳特征，從而使得人們能夠使用特定的選擇培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)化的新細(xì)胞（即轉(zhuǎn)化子），從其親本細(xì)胞群體中選擇出來(lái)的一類特殊的基因。報(bào)告基因：特指其編碼產(chǎn)物能被快速檢測(cè)，常用來(lái)判斷外源基因是否已經(jīng)成功地導(dǎo)入寄主細(xì)胞、器官或組織的一類特殊基因?；蚬こ陶Q生的理論基礎(chǔ)（1） 20世紀(jì)40年代確定了遺傳信息的攜帶者（分子載體）是DNA而不是蛋白質(zhì)。（2） 20世紀(jì)50年代的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型與半保留復(fù)制機(jī)理⑶20世紀(jì)50末60初，科技工作者提出中心法則和操縱子學(xué)說(shuō)，遺傳密碼的破譯，闡明了信息流的方向。基因工程誕生的技術(shù)基礎(chǔ)（1）核酸內(nèi)切限制酶，DNA的體外切割與連接，DAN連接酶；（2）DNA核苷酸測(cè)序技術(shù)；（3）基因克隆載體的發(fā)展與應(yīng)用；（4）大腸桿菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的建立；（5）瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)應(yīng)用；（6）核酸雜交技術(shù)的應(yīng)用。酶的分類：氧化還原酶類，轉(zhuǎn)移酶類，水解酶類，異構(gòu)酶類，裂解酶類，連接酶類。共線性的概念（1） 位于同一條染色體DNA或DNA分子上不同基因的位置排列關(guān)系；（2） 不同物種中DNA的排列關(guān)系；（3） 位于DNA分子及其轉(zhuǎn)錄本RNA分子間的共線性；（4） mRNA密碼的順序與蛋白質(zhì)氨基酸順序。切口（Nick）:在雙鏈DNA的某一條鏈上兩個(gè)相鄰核苷酸之間失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂。裂口（Gap）:指雙鏈DNA分子的某一條鏈上，失去一個(gè)或連續(xù)幾個(gè)核苷酸時(shí)所出現(xiàn)的DNA單鏈斷裂。DNA連接酶無(wú)法封閉裂口。核算內(nèi)切限制酶：是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。n型核酸內(nèi)切限制酶的特點(diǎn)與I型、口型不同，不具備多亞基的結(jié)構(gòu)，可在沒(méi)有修飾的情況下切割；(2)識(shí)別雙鏈DNA分子的限制位點(diǎn)；(3)切割位點(diǎn)發(fā)生兩條鏈切割，形成互補(bǔ)黏性末端；酶切反應(yīng)不需要能量；因兩個(gè)單鏈切割部位是交錯(cuò)的，黏性末端互補(bǔ)。影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素DNA的分子特性a識(shí)別位點(diǎn)周圍核苷酸堿基成分可影響其底物DNA消化的速率，有時(shí)達(dá)25倍；b特定DNA分子中所具有的目標(biāo)限制位點(diǎn)的密度；c完全超螺旋DNA分子比線性DNA分子消化時(shí)需要更多的酶；dDNA分子的甲基化程度，如果位點(diǎn)發(fā)生甲基化，會(huì)強(qiáng)烈干擾核酸內(nèi)切限制酶的活性。(2)酶切消化反應(yīng)的溫度，大多最適溫度為37。仁DNA制劑的純度對(duì)酶切活性的影響，制劑中的污染物：酚，氯仿，蛋白質(zhì)，酒精，甘油，高鹽，SDS,EDTA等；星號(hào)活性：在反應(yīng)條件發(fā)生變更的情況下，核酸內(nèi)切限制酶便失去了切割其固有識(shí)別序列的能力，而會(huì)在新的識(shí)別序列上發(fā)生DNA分子切害K這種發(fā)生了改變的限制酶活性，叫做星號(hào)(*)活性，或限制酶星號(hào)活性。產(chǎn)生星號(hào)活力的原因：(1)酶用量的單位數(shù)與DNA用量的比值過(guò)高，超過(guò)10U/四；(2)甘油濃度不可超過(guò)5%；(3)二價(jià)離子Mg2+被Mn2+、Cu2+Zn2+Ca2+取代；(4)Mg2+濃度低于25mmol/L(5)BufferpH不能高于8；(6)有機(jī)溶劑的干擾。DNA分子體外連接條件一條DNA鏈3’端存在游離的3’-OH一條DNA鏈5’端存在游離的5’-磷酸基團(tuán)連接體系需要能量ATP堿性磷酸酶的類型：a細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)b小牛腸堿性磷酸酶(CIP)平末端DNA片段連接的方法(1)T4DNA連接酶連接法(2)同聚物加尾法(3)限制片段末端修飾法銜接物連接法(5)DNA接頭連接法T載體結(jié)構(gòu)上有哪些優(yōu)點(diǎn)？T載體是一種線性雙鏈DNA，不需切割，即可擴(kuò)增PCR產(chǎn)物；3’-T單核苷酸延伸末端，可直接與PCR產(chǎn)物具有3’-A單核苷酸延伸的分子進(jìn)行堿基互補(bǔ)；(3)線性載體已經(jīng)脫去5’-P,自己不會(huì)再環(huán)化；(4)T載體中設(shè)計(jì)了LacZ基因，可通過(guò)顯色反應(yīng)X-gal顯色反應(yīng)分離重組體；在T載體的3’末端附近還設(shè)計(jì)了多個(gè)核苷酸酶切位點(diǎn)，便于進(jìn)行多種亞克?。籘載體含有T7,SP6兩種啟動(dòng)子，便于測(cè)序。理想的質(zhì)粒載體應(yīng)具備的條件(載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn))：必須具備復(fù)制起點(diǎn)；具有抗生素抗性基因；具有若干核酸內(nèi)切限制酶的酶切位點(diǎn)；具有較小的分子量，較高的拷貝數(shù)。入噬菌體基因組結(jié)構(gòu)左側(cè)區(qū)，自基因A到基因J,包括參與噬菌體頭部蛋白質(zhì)和尾部蛋白質(zhì)合成所需要的全部基因；中央?yún)^(qū)，介于基因J與基因N之間，非必要區(qū)，編碼的基因與保持噬菌斑形成能力無(wú)關(guān)，但包含了一些與重組有關(guān)的基因，以及使噬菌體整合到大腸桿菌染色體中去的int基因，和把原噬菌體從寄主染色體上刪除下來(lái)的xis基因；右側(cè)區(qū)，位于N基因的右側(cè)，包括全部主要的調(diào)控基因，復(fù)制基因，溶菌基因。入噬菌體載體的主要類型取代型，插入型入ZAP的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)入ZAP是一種典型的插入型入噬菌體載體，可將插入的DNA片段直接從入載體轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒載體。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：(1)其兩側(cè)是由兩個(gè)單鏈DNA噬菌體fl的復(fù)制信號(hào)，即fl起始子和fl終止子包圍著；(2)含有一個(gè)可以在體內(nèi)發(fā)生刪除作用的pBluescript噬菌粒的DNA片段；在pBluescript噬菌粒兩端有T3和T7噬菌體啟動(dòng)子的多克隆位點(diǎn)區(qū)，可制備RNA探針。入ZAP的優(yōu)點(diǎn)(1)具有多種核酸內(nèi)切限制酶的單切點(diǎn)，可以克隆分子量達(dá)到10kb左右的外源DNA片段；(2)在插入外源DNA序列保證正確的取向和正確的讀碼結(jié)構(gòu)的情況下，能夠與外源DNA表達(dá)的蛋白形成融合蛋白；(3)LacZ基因的N端有6個(gè)單克隆位點(diǎn)，能夠發(fā)生8-半乳糖苷酶的插入失活效應(yīng)，故可以在X-gal顯色反應(yīng)平板上篩選重組體分子;(4)利用T3或T7啟動(dòng)子能夠轉(zhuǎn)錄任一條鏈的mRNA，可以方便制備外源DNA插入序列的轉(zhuǎn)錄本；通過(guò)內(nèi)刪除作用，插入的外源DNA可自動(dòng)從入噬菌體載體轉(zhuǎn)移到細(xì)菌質(zhì)粒載體便于構(gòu)建限制圖譜或測(cè)序，省略了亞克隆。柯斯質(zhì)粒及其特點(diǎn)柯斯質(zhì)粒：是一類人工構(gòu)建的含有入噬菌體DNA的cos序列，和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體，其DNA可以在體外被包裝到噬菌體的外殼內(nèi)。其基本特點(diǎn)：具有入噬菌體的特性；(2)具有質(zhì)粒載體的特性；具有高容量的克隆能力；(4)具有與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。M13克隆體系M13克隆體系，包括M13噬菌體本身和寄主菌株兩個(gè)組成部分。二者單獨(dú)都不能產(chǎn)生有功能的8-半乳糖苷酶，只有二者結(jié)合才能產(chǎn)生此酶，這種酶的活性可用X-gal顯色反應(yīng)法測(cè)定出來(lái)。M13載體系列的優(yōu)點(diǎn)：(1)可以分離特定的DNA單鏈序列；(2)可以用組織化學(xué)測(cè)試技術(shù)檢測(cè)；在LacZ基因上具有多克隆位點(diǎn)，便于外源基因的插入、檢測(cè)；(4)可以定向克隆。順?lè)醋觾?nèi)互補(bǔ)作用：是指編碼同樣的多肽鏈序列但又各具有一個(gè)突變的兩個(gè)基因，聯(lián)合產(chǎn)生出一種有功能活性的蛋白質(zhì)多肽的生化過(guò)程。噬菌粒載體：是一類有質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的新型的載體系列。結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：具有兩個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，質(zhì)粒復(fù)制點(diǎn)和噬菌體復(fù)制點(diǎn)，有抗生素標(biāo)記信號(hào)，與形態(tài)發(fā)生有關(guān)的DNA序列。mRNA差別顯示法分離目的基因的優(yōu)缺點(diǎn)這是建立在基因差別表達(dá)的理論基礎(chǔ)上，通過(guò)比較不同的個(gè)體、或是同一個(gè)體的不同組織、甚至不同的發(fā)育階段之間的mRNA種的差異，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)而發(fā)展出來(lái)的一種分離產(chǎn)物未知基因的方法。簡(jiǎn)稱DDRT-PCR。主要包括：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，PCR反應(yīng)，凝膠電泳。(考試不要求)基本原理：幾乎所有的真核基因mRNA分子的3'-末端都有一段poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶作用下，可按mRNA為模板，以oligo(dT)為弓物合成出cDNA拷貝。根據(jù)mRNA分子3'-端序列結(jié)構(gòu)分析，在這段poly(A)序列起點(diǎn)堿基之前的兩個(gè)堿基，除了倒二位的堿基為A的情況之外，只能有如下12種可能的排列組合；根據(jù)上述mRNA分子結(jié)構(gòu)特征設(shè)計(jì)3'-端錨定引物，用以反轉(zhuǎn)錄mRNA合成第一鏈cDNA的下游引物，共12種。其通式為：5'-T11MN或5'-T12MN，其中T11或T12表示11個(gè)或12個(gè)連續(xù)的T核苷酸，M表示除T以外的任何一種核苷酸，即A、G、C,N表示任何一種核苷酸，即A、T、G、C。由此可見(jiàn)MN(3x4)總共只有12種不同的排列組合方式。由此可知，使用5'-T11MN弓物或5'-T12MN引物，可以將整個(gè)mRNA群體在cDNA水平上，分成大致相等的位序列結(jié)構(gòu)不同的12個(gè)分亞群體。對(duì)每一類cDNA進(jìn)行隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄引物PCR擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)組織樣品的同一類cDNA的PCR選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析，從而反映出不同樣品間基因的時(shí)間和空間上組織特異性的表達(dá)。優(yōu)點(diǎn)：(1)可以同時(shí)比較多個(gè)樣品間基因表達(dá)的差異；(2)可以同時(shí)檢測(cè)到“上游”及“下游”基因；(3)檢測(cè)靈敏度高，所需樣品少，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增一些低豐度的mRNA也可以被檢測(cè)出來(lái)；(4)結(jié)合使用了PCR和序列膠電泳分析兩項(xiàng)技術(shù)，使本方法的使用顯得更加簡(jiǎn)單方便。缺點(diǎn)：(1)假陽(yáng)性比例甚高，通常可高達(dá)50%-70%;(2)擴(kuò)增的差別條帶的分子長(zhǎng)度比較短小，一般在110?450bp之間；工作量大，理論統(tǒng)計(jì)為分離一種差別表達(dá)的基因應(yīng)檢測(cè)的差示組為803=240對(duì)反應(yīng)；DNA標(biāo)簽法分離目的基因的原理DNA標(biāo)簽法(DNAtagging)，是根據(jù)DNA的插入作用發(fā)展出來(lái)的一種分離基因的方法，其依據(jù)的原理是：當(dāng)一段特定的DNA插入到植物基因組中目的基因的內(nèi)部、或其鄰近位點(diǎn)時(shí)，便會(huì)誘發(fā)該基因發(fā)生突變，并最終導(dǎo)致表型變化，形成突變體(突變植株)；如果此段DNA插入序列是已知的，那么它便可以用來(lái)作為DNA雜交的分子探針，從突變體植株的基因組DNA文庫(kù)中篩選到突變的基因；利用此突變基因作探針，就能從野生型植株的基因組DNA文庫(kù)中克隆出野生型的目的基因。酵母雙雜交體系的基本原理酵母雙雜交體系(two-hybridsystem)是90年代初期在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種敏感的體內(nèi)鑒定基因的方法。它可有效地用來(lái)分離能與一種已知的靶蛋白（targetprotein）相互作用的蛋白質(zhì)的編碼基因。許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)生可以分開(kāi)的、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成的。釀酒酵母的半乳糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4，在N端1?147位氨基酸區(qū)段有一個(gè)DNA結(jié)合域（DNA-BD），在C端768?881位氨基酸區(qū)段有一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活域（簡(jiǎn)稱AD）。DNA-BD能夠識(shí)別位于GAL4效應(yīng)基因上游的—個(gè)特定區(qū)段，即上游激活序列（UAS），并與之結(jié)合。而AD則是通過(guò)同轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)中的其它成份之間的結(jié)合作用，以啟動(dòng)UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域都是激活基因轉(zhuǎn)錄的必要條件，而且在正常的情況下它們都是同一種蛋白質(zhì)的組成部分。但是，如果應(yīng)用DNA重組技術(shù)把它們從形體上彼此分開(kāi)，并方攵置在同一寄主細(xì)胞中表達(dá)。那么，由此產(chǎn)生的GAL4DNA-BD和AD多肽，彼此之間就不會(huì)直接地發(fā)生相互作用，故不能激活其相關(guān)的效應(yīng)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。實(shí)驗(yàn)同樣也證明，應(yīng)用重組DNA技術(shù)，也可以將來(lái)自同一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的、或是兩種不同轉(zhuǎn)錄因子的、分開(kāi)的兩種結(jié)構(gòu)域（即DNA-BD和AD），在體內(nèi)重新組裝成具有功能的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活UAS下游啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的報(bào)告基因的表達(dá)。新基因功能鑒定的方法（1）轉(zhuǎn)基因技術(shù)使基因過(guò)表達(dá)；（2）基因剔除；（3）RNA干擾技術(shù)；（4）基因序列同源比對(duì)；（5）蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能分析；（6）基因定點(diǎn)突變技術(shù)；（7）應(yīng)用報(bào)告基因；（8）反譯RNA技術(shù);（9）化學(xué)遺傳方法；（10）遺傳互補(bǔ)法；（11）基因表達(dá)系列分析法；（12）酵母雙雜交技術(shù)。45.同源基因的類型（1） 直向同源基因：又叫定向進(jìn)化同源基因，是從共同的祖先基因進(jìn)化而來(lái)，分布在不同的物種中。（2） 共生同源基因：又叫平行進(jìn)化同源基因，指存在于同種生物中的一類同源基因。RNA干擾：小分子量的外源雙鏈RNA進(jìn)入寄主細(xì)胞之后，便可促進(jìn)與其同源的內(nèi)源mRNA發(fā)生特異性的降解作用，從而高效而特異的阻斷體內(nèi)相應(yīng)基因的活性(即呈現(xiàn)基因沉默的狀態(tài))，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮基因剔除的作用，此種現(xiàn)象叫做RNA干擾簡(jiǎn)稱RNAi切丁酶：是一種RNasem樣的核酸內(nèi)切酶。其生物學(xué)功能是將雙鏈RNA分子切成21~23bp的小分子量干擾RNA，即siRNA。調(diào)節(jié)子：指在大腸桿菌基因組中，其表達(dá)活性受同一種基因編碼的蛋白質(zhì)協(xié)同調(diào)節(jié)的，一組不連續(xù)相鄰排列的結(jié)構(gòu)基因。調(diào)節(jié)子與操縱子的不同之處在于，后者的結(jié)構(gòu)基因是彼此相鄰排列的，而前者的結(jié)構(gòu)基因則是分散于染色體的不同部位，甚至是位于不同的染色體上。原核基因表達(dá)的調(diào)節(jié)方式操縱子的調(diào)節(jié)方式；功能相關(guān)的若干基因聚集在一起組成一個(gè)操縱子，即在同一個(gè)啟動(dòng)子控制下的一種單一的轉(zhuǎn)錄單位。調(diào)節(jié)子的調(diào)節(jié)方式；調(diào)節(jié)子：大腸桿菌基因組中，其表達(dá)活性受到同一種調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)，并對(duì)同一種信號(hào)做出反應(yīng)的一組不連續(xù)也不相鄰的結(jié)構(gòu)基因或者操縱子。兩種常見(jiàn)的大腸桿菌調(diào)節(jié)子：麥芽糖調(diào)節(jié)子和精氨酸調(diào)節(jié)子。(3)適應(yīng)性效應(yīng)的調(diào)節(jié)方式大腸桿菌在外界環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，其新陳代謝能夠迅速的改變，叫適應(yīng)性效應(yīng)。正調(diào)節(jié)與負(fù)調(diào)節(jié)正調(diào)節(jié)：當(dāng)調(diào)節(jié)蛋白處于激活狀態(tài)時(shí)，能夠啟動(dòng)操縱子的表達(dá)，這樣的操縱子受到了正調(diào)節(jié)蛋白的正調(diào)節(jié)。負(fù)調(diào)節(jié)：當(dāng)一種調(diào)節(jié)蛋白處于激活狀態(tài)時(shí)，能夠關(guān)閉操縱子的表達(dá)活性，這樣的操縱子受到了阻遏物的調(diào)節(jié)。程序化環(huán)路與快速開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)程序化環(huán)路：大腸桿菌按照預(yù)先決定的遺傳程序?qū)虮磉_(dá)進(jìn)行控制的調(diào)節(jié)方式。快速開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)：在大腸桿菌中，為了適應(yīng)環(huán)境的瞬時(shí)變化，迅速地開(kāi)啟或關(guān)閉有關(guān)基因的表達(dá)活性，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的比較對(duì)弓物的需求有差別：復(fù)制需要同時(shí)存在模板和引物，DNA聚合酶才能啟動(dòng)新鏈的合成，而轉(zhuǎn)錄不需要引物，RNA聚合酶便可啟動(dòng)新鏈的合成；使用的底物不完全相同：復(fù)制的底物是脫氧核糖核酸，轉(zhuǎn)錄的底物是核糖核苷酸(3)與模板結(jié)合的狀:態(tài)不一樣：復(fù)制是半保留復(fù)制，新鏈與模板鏈結(jié)合在一起除非堿變性或高溫；轉(zhuǎn)錄新合成的RNA鏈從模板上解離下來(lái)；(4)精確性程度相差懸殊：轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，錯(cuò)誤的頻率是10-4;在復(fù)制過(guò)程中，出錯(cuò)的頻率是10-7，復(fù)制的保真性是轉(zhuǎn)錄的1000被倍；涉及的范圍不同：DNA復(fù)制:涉及整個(gè)基因組；轉(zhuǎn)錄則只涉及部分序列。RNA編輯：在某些基因的轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程中，會(huì)有大量的尿嘧啶核苷酸加入到pre-mRNA上，或者從pre-mRNA上刪除，或發(fā)生核苷酸的取代，如此堿基飾變的結(jié)果，使得RNA轉(zhuǎn)錄物的核苷酸編碼序列與其對(duì)應(yīng)的DNA鏈的核苷酸編碼序列并不完全匹配。這種RNA轉(zhuǎn)錄物成熟、修飾過(guò)程中發(fā)生的核苷酸堿基的加入或刪除的現(xiàn)象,叫做RNA編輯。引導(dǎo)RNA分子結(jié)構(gòu)gRNA是一類長(zhǎng)度為50?80個(gè)核苷酸，可以同mRNA轉(zhuǎn)錄物雜交的小分子量RNA分子。gRNA分子能夠使mRNA分子缺失核苷酸，或?qū)⒑塑账峒尤氲絤RNA分子上，而這種缺失或加入的核苷酸通常是尿嘧啶核苷酸。gRNA的分子結(jié)構(gòu)：(1)在gRNA的5’末端有一段錨定區(qū)，以特殊的G-U配對(duì)方式與pre-mRNA編輯序列互補(bǔ)，錨定序列促進(jìn)gRNA與pre-mRNA中的編輯區(qū)互補(bǔ)，特異結(jié)合；（2） 在gRNA分子的中間部位也有一個(gè)編輯區(qū)負(fù)責(zé)在被編輯的pre-m