美多芭與安坦攝入后帕金森病大鼠行為學(xué)及大腦5-羥色胺表達(dá)的改變

美多芭與安坦攝入后帕金森病大鼠行為學(xué)及大腦5-羥色胺表達(dá)的改變

帕金森?。╬arkinson’sdisease，pd）是老年人的進(jìn)展性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要以運(yùn)動(dòng)癥狀為特征，但近年來(lái)，抑郁、焦慮和智力低下等非運(yùn)動(dòng)癥狀逐漸引起人們的注意。PD患者伴發(fā)抑郁(depressioninPD,dPD)是PD患者最主要的精神癥狀并發(fā)癥之一,Reijnders等總結(jié)了2007年之前(包括2007年)有關(guān)dPD研究的文獻(xiàn),認(rèn)為平均35%的PD患者伴有臨床表現(xiàn)明顯的抑郁癥狀。dPD嚴(yán)重影響患者與家人的生活質(zhì)量,因此,認(rèn)識(shí)并且治療PD患者的抑郁癥狀對(duì)降低PD患者的殘疾與改善預(yù)后具有重要意義。dPD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,包括社會(huì)心理學(xué)、病理、生理、治療因素等多方面原因,目前抗PD治療對(duì)情緒的影響日益受到重視。本研究選取PD治療最常用的藥物美多芭(Madopar)與安坦(Artane)進(jìn)行研究,探討dPD可能的發(fā)生原因及抗PD藥物治療對(duì)情緒的影響與作用途徑。1材料和方法1.1抗鼠5-ht多克隆抗體清潔級(jí)成年健康雄性Wistar大鼠120只,體質(zhì)量260～280g,由山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供;6-羥基多巴胺(6-hyaroxyaopamine,6-OHDA)與阿樸嗎啡(apomorphine,APO)(Sigma公司,美國(guó));兔抗鼠5-HT多克隆抗體(Abcam公司,美國(guó));抗兔/鼠通用型免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒與DAB顯色劑(武漢博士德生物工程有限公司);微量注射器(上海安亭微量進(jìn)樣器廠);自動(dòng)脫水機(jī)、包埋機(jī)和病理切片機(jī)(LEICA公司,德國(guó));OLYMPUS光學(xué)顯微鏡和OLYMPUS照相顯微鏡(SONY公司,日本)。1.2方法1.2.1實(shí)驗(yàn)組從120只大鼠中隨機(jī)取30只,再隨機(jī)分為空白對(duì)照組與假手術(shù)組,各15只,給予自由飲水進(jìn)食。1.2.2誘導(dǎo)大鼠旋轉(zhuǎn)剩余的90只大鼠稱(chēng)重,麻醉后固定于立體定向儀,參照大鼠腦立體定向圖譜,使用微量注射器將6-OHDA8μL(溶于生理鹽水,2μg/μL)注入右側(cè)紋狀體。2周后,APO0.5mg/kg誘導(dǎo)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn),每周1次連續(xù)4周,每次旋轉(zhuǎn)均向左側(cè),每分鐘大于7圈,則PD動(dòng)物模型建立成功。假手術(shù)組注射等量生理鹽水代替6-OHDA,其余步驟同模型制作。APO誘導(dǎo)后,始終不旋轉(zhuǎn)。實(shí)驗(yàn)造模成功大鼠55只,隨機(jī)取45只,分為PD組、美多芭組與安坦組各15只。每日美多芭及安坦組胃內(nèi)分別灌注美多芭(使左旋多巴L-dopa含量為12mg/kg)與安坦(0.45mg/kg)連續(xù)3個(gè)月。其他組大鼠每日灌注等量生理鹽水。1.2.3行為測(cè)試1.2.3.1行為觀察與體重測(cè)量停藥24h后,觀察喂養(yǎng)3個(gè)月各組大鼠的日常行為表現(xiàn),并分別測(cè)量各組大鼠的體質(zhì)量,求平均值以xˉ±sxˉ±s表示。1.2.3.蔗糖水與蔗糖水處理1%蔗糖水偏好度測(cè)定:實(shí)驗(yàn)前,先訓(xùn)練各組大鼠適應(yīng)飲含糖水,第1個(gè)24h每籠放兩瓶1%的蔗糖水,第2個(gè)24h,分別放1瓶1%的蔗糖水與1瓶自來(lái)水,在禁食禁水12h后,進(jìn)行糖水實(shí)驗(yàn)。每籠分別放1瓶1%的蔗糖水與1瓶自來(lái)水,12h后交換兩瓶水的位置,分別觀察記錄大鼠24h飲用自來(lái)水與1%的蔗糖水量,排除大鼠可能飲水習(xí)慣的影響。計(jì)算大鼠糖水偏愛(ài)度(蔗糖水消耗量/總液體消耗量×100%),并求平均值以xˉ±sxˉ±s表示。1.2.4組織碎片的制備心臟灌注、斷頭取腦,將大腦額葉與海馬區(qū)腦組織放入4%多聚甲醛中,石蠟包埋,切成5μm切片。1.2.5不同的人工林和生物素質(zhì)石蠟切片取出后置溫箱65℃30min;脫蠟;梯度酒精水化;枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù):將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液的容器中,微波爐內(nèi)加熱使緩沖液溫度保持在92～98℃之間持續(xù)10～15min,注意不要沸騰。冷卻后,PBS沖洗5min,3次;3%H2O2并37℃孵育10min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,PBS沖洗5min,3次;5%BSA封閉液,37℃孵育20min,甩去多余的液體,勿洗;加入兔抗鼠5-HT抗體(1∶500);加入生物素化二抗,完全覆蓋組織,濕盒37℃孵育20min,PBS沖洗5min,3次;DAB顯色,室溫避光顯色,顯微鏡下觀察切片,反應(yīng)時(shí)間一般在5～10min之間。蒸餾水洗滌。自來(lái)水充分沖洗;蘇木素復(fù)染;1%鹽酸酒精分色10s,自來(lái)水充分沖洗;返藍(lán)、梯度酒精脫水、透明、封片?？瞻讓?duì)照用0.01mmol/LPBS代替一抗,結(jié)果為陰性,以已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。1.2.65-ht染色觀察據(jù)低倍鏡觀察,找到海馬及額葉神經(jīng)細(xì)胞分布的部位,每例隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野,計(jì)數(shù)陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞,計(jì)算平均值。1.3檢驗(yàn)基準(zhǔn)檢驗(yàn)使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。計(jì)量資料的數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1理想國(guó)里環(huán)境因素空白對(duì)照組與假手術(shù)組表現(xiàn)較各組PD大鼠行為活躍,在有人靠近與喂食及喂水時(shí),較多在籠內(nèi)出現(xiàn)繞籠子轉(zhuǎn)圈奔跑、直立、抬頭張望等行為,而每組PD大鼠的這些活動(dòng)明顯減少,對(duì)外界條件改變反應(yīng)遲鈍。2.2平均體質(zhì)量測(cè)定見(jiàn)表1。PD組、美多芭組、安坦組大鼠平均體質(zhì)量明顯低于空白對(duì)照組與假手術(shù)組(P<0.05),美多芭組與安坦組平均體質(zhì)量低于PD組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;PD組、美多芭組、安坦組大鼠糖水偏愛(ài)度明顯低于空白對(duì)照組與假手術(shù)組(P<0.05),美多芭組與安坦組糖水偏愛(ài)度明顯低于PD組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);安坦組糖水偏愛(ài)度低于美多芭組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.3大葉和馬尾辮組5-ht免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞的計(jì)數(shù)2.3.15-ht免疫組化結(jié)果顯微鏡下可見(jiàn)在5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性的神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi),表達(dá)位于胞漿,呈棕黃色,分布均勻,細(xì)胞核被蘇木素復(fù)染成藍(lán)色。2.3.2美多美對(duì)5-ht的影響在額葉與海馬,美多芭組5-HT免疫反應(yīng)明顯弱于其他組。陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05,表2),著色變淺(圖1、圖2)。2.3.3報(bào)道中的5-htPD組與安坦組5-HT免疫反應(yīng)弱于假手術(shù)組與空白對(duì)照組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PD組與安坦組相比,免疫反應(yīng)無(wú)明顯差異(表2)。3不同的、心理狀態(tài)的大鼠抑郁行為L(zhǎng)-dopa是PD診斷與藥物治療的金標(biāo)準(zhǔn)。大多數(shù)患者在其病程中都會(huì)接受L-dopa制劑的治療,但隨著病情的進(jìn)展與用藥時(shí)間的延長(zhǎng),其效果會(huì)逐漸減退,并出現(xiàn)一系列的運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥。近年來(lái),L-dopa制劑治療相關(guān)的非運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥,如神經(jīng)精神癥狀已逐漸引起人們的注意。美多芭可以顯著改善PD的運(yùn)動(dòng)癥狀,但本研究發(fā)現(xiàn),較空白對(duì)照組與PD組,經(jīng)美多芭處理后,大鼠抑郁程度并沒(méi)有減輕而是明顯加重,所以我們認(rèn)為美多芭的攝入可以加重PD的抑郁情況。本研究強(qiáng)調(diào)了美多芭的影響,因?yàn)橹委焺┝康拿蓝喟趴梢悦黠@增加紋狀體之外大腦其他部分多巴胺(dopamine,DA)的釋放。額葉皮質(zhì)與海馬都表達(dá)有DA受體,且與情緒與認(rèn)知功能有關(guān),美多芭引起的這些區(qū)域過(guò)量的神經(jīng)遞質(zhì)DA的傳遞可能與PD治療的運(yùn)動(dòng)與非運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥有關(guān)。同時(shí),5-HT免疫組化染色結(jié)果顯示,在美多芭組額葉與海馬5-HT免疫反應(yīng)明顯弱于其他各組,所以,我們認(rèn)為,美多芭的攝入可以導(dǎo)致額葉與海馬5-HT水平的降低,美多芭組大鼠抑郁的加重與它導(dǎo)致5-HT水平的降低有關(guān)。5-HT是許多情感障礙異常研究的焦點(diǎn),在PD患者與PD動(dòng)物也受到關(guān)注。由于5-HT能神經(jīng)元沒(méi)有像黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元相同的抗氧化機(jī)制,所以它們更容易受到L-dopa/DA合成及代謝的副產(chǎn)品如醌類(lèi)物質(zhì)的影響。有研究發(fā)現(xiàn),5-HT能突觸可以接受外源性L-dopa并將其轉(zhuǎn)變?yōu)镈A,作為假性神經(jīng)遞質(zhì)(falseneurotransmitter)釋放入紋狀體。因此,美多芭組大鼠在DA能系統(tǒng)受損,攝入外源性L-dopa后,5-HT能神經(jīng)元作為DA能神經(jīng)元的替代品,將L-dopa轉(zhuǎn)變?yōu)镈A并將其釋放到大腦中,這種行為是以失去正常的5-HT系統(tǒng)功能為代價(jià)的,在美多芭治療后5-HT含量的降低,是抑郁發(fā)生的推動(dòng)力。抑郁的發(fā)生與總體的認(rèn)知功能及某些特殊的認(rèn)知障礙有關(guān)。Zoccolella等總結(jié)了從1966年至2010年3月31日所有關(guān)于同型半胱氨酸(homocysteine,HCY)與PD認(rèn)知功能損害和癡呆關(guān)系的16項(xiàng)研究,大數(shù)研究中L-dopa治療后HCY濃度升高,而血漿的HCY濃度與患者認(rèn)知功能、癡呆、PD患者神經(jīng)變性的標(biāo)記物明顯相關(guān),進(jìn)而可能導(dǎo)致抑郁的發(fā)生。但本實(shí)驗(yàn)并未對(duì)血漿HCY濃度進(jìn)行測(cè)定,所以該結(jié)論需要進(jìn)一步的研究來(lái)確定。安坦為中樞抗膽堿抗PD藥,在PD中由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)DA能神經(jīng)元的丟失,DA能系統(tǒng)功能減弱使膽堿能系統(tǒng)相對(duì)的增強(qiáng),導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)癥狀的發(fā)生,所以臨床使用安坦,發(fā)揮其抗膽堿和治療震顫的作用。在我國(guó),尤其是農(nóng)村地區(qū),由于安坦價(jià)格便宜,而被廣為應(yīng)用。然而許多患者服用安坦后,出現(xiàn)口干、尿潴留、幻覺(jué)和認(rèn)知功能減退等癥狀,但有關(guān)它對(duì)情感障礙尤其是抑郁的影響,仍未有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示,安坦治療后的大鼠,較空白對(duì)照組與PD組大鼠表現(xiàn)出更明顯的抑郁。但是安坦組與PD組、空白對(duì)照組、假手術(shù)組相比,5-HT在額葉與海馬的表達(dá)沒(méi)有明顯差異,提示安坦對(duì)認(rèn)知功能的影響不是通過(guò)改變大腦5-HT的水平來(lái)發(fā)揮作用。抑郁的產(chǎn)生,我們認(rèn)為可能與安坦引起的其他并發(fā)癥有關(guān),如認(rèn)知功能的減退。安坦可導(dǎo)致PD患者明顯的認(rèn)知功能減退,而抑郁的發(fā)生與總體的認(rèn)知能力,及某些特殊的認(rèn)