waters-液相操作SOP資料

WATERS高效液相的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）試用稿制定人：適用于本教研室所有使用此儀器者1流動相的處理1.1過濾溶劑溶劑在使用前一定要用0.5μm的過濾器過濾，如果使用固體化學(xué)試劑（緩沖鹽）配制流動相，過濾特別重要，不能讓固體微粒污染泵，阻塞進(jìn)樣器和柱頭過濾片。本實驗室有水溶性和脂溶性兩種過濾膜供選擇（反光面朝上），過濾水溶性流動相時（如甲醇/水），先用1-2ml甲醇潤濕過濾膜，有助于快速抽濾。1.2保持儲液瓶的清潔用普通溶劑瓶作流動相儲液器應(yīng)不定期廢棄瓶子，最后一次應(yīng)用HPLC級的水或溶劑清洗，不能在清洗過程中留下污跡。1.3保證溶劑的質(zhì)量一定要用HPLC級的溶劑，水也應(yīng)達(dá)到HPLC級，同樣也要使用高純度的緩沖鹽。1.4故障及解決方法1.4.1流動相脫氣不充分流動相受熱，或者流動相不同組分混合時會有氣體產(chǎn)生，氣泡進(jìn)入泵內(nèi)引起壓力波動，增加噪音，色譜圖上出現(xiàn)毛刺?？稍囉孟铝蟹椒ń鉀Q問題：流動相再脫氣；采用更有效的脫氣方法或兩種方法配合使用；改系統(tǒng)內(nèi)混合為系統(tǒng)外預(yù)混合。1.4.2流動相供給不暢流動相用完，管道中吸入氣體引起泵壓力不穩(wěn)。應(yīng)經(jīng)常觀察儲液器中流動相的量，加足流動相保證所有的樣品分析完畢。輸液管道上裝沉子沉至瓶底，儲液器蓋上留一小孔正好夾住進(jìn)液管，使其不能上下移動。過濾器阻塞引起管道和泵腔空化，壓力不穩(wěn)。過濾器被微粒所阻塞或長霉，去掉過濾器后如果系統(tǒng)運轉(zhuǎn)正常，說明已找出問題，換上新的過濾器則可。有時候換上新的過濾器仍然不暢，那就需要查查流動相的制備過程，或者換大孔徑的過濾器。不管如何，流動相都需要重新過濾。流速過高、阻力大，造成空化現(xiàn)象，這是由于過濾器孔徑、管道內(nèi)徑、流速和溶劑黏度等引起的。如果流速大于10ml/min，常會出現(xiàn)這種現(xiàn)象。使用下列方法解決：（1）使用低流速；（2）換大孔徑的過濾器；（3）增加進(jìn)液管道內(nèi)徑；（4）抬高或加壓儲液器；（5）不用過濾器，但流動相一定要先過濾；（6）儲液器蓋子太緊，在儲液器內(nèi)形成真空，打出的流動相不連續(xù)。應(yīng)松開蓋子或留有1mm的縫隙；（7）進(jìn)液管道阻塞或彎曲使泵抽不到液，注意調(diào)整進(jìn)液管道或更換新的。其它問題包括滲漏或接頭松動、泵部件損壞等，都能引起供液不正常。1.4.3流動相和儲液器被污染由于污染，噪音越來越大，檢測器基線上升。污染物可能被泵以穩(wěn)定的濃度打入系統(tǒng)，而再以穩(wěn)定的濃度流出來，所以在色譜圖中不出多余的峰。用梯度洗脫時弱流動相可以使污染物聚在柱頂，流動相強度增加后污染物可能被洗脫出來一個大的偽峰。有時基線噪音突然增大或突然提高，都是因為反復(fù)加進(jìn)新的流動相或系統(tǒng)用得太久（通宵）所造成的。新加進(jìn)的流動相有污染物或者流動相長霉，繁殖了細(xì)菌。臟的儲液器會污染清潔的流動相。每種流動相備有專用的儲液器，或者定期報廢儲液器。流動相污染來自這幾個方面：試劑質(zhì)量不高，玻璃器皿不合格；微生物的影響；配制流動相時操作不當(dāng)?shù)取Ｒ虼艘蟾呒兌然瘜W(xué)試劑和HPLC級溶劑。玻璃器皿按規(guī)定清洗干凈。為防止微生物生長，每天要用甲醇清洗系統(tǒng)。懷疑系統(tǒng)內(nèi)生長了微生物，可用稀硝酸沖洗既可（注意不要損壞柱和管道系統(tǒng)）真空脫氣時防止泵油帶入流動相。用清潔的惰性塞子、攪棒、過濾器和玻璃器皿配制流動相。已經(jīng)污染的流動相一定要廢棄掉。2儀器組成及電源本系統(tǒng)可進(jìn)行多達(dá)四元溶劑的梯度洗脫操作2.1儀器組成本系統(tǒng)由Waters600E多溶劑輸送系統(tǒng)，四通道在線過濾，7725i進(jìn)樣器，996型二極管陣列檢測器，聯(lián)想品牌機(jī)等單元組合而成。2.2電源儀器使用時按泵、檢測器、打印機(jī)和計算機(jī)的順序，依次接通電源。3600E高壓輸液泵的操作3.1液相色譜系統(tǒng)泵的流速在0.1-10.0ml/min之間，要保持泵的良好操作性能，必須維護(hù)系統(tǒng)的清潔，保證溶劑和試劑的質(zhì)量，流動相的過濾和流動相的脫氣。下面列出預(yù)防泵故障的注意事項：（1）用高質(zhì)量的試劑和HPLC級溶劑；（2）過濾流動相和溶劑；（3）脫氣；（4）工作時使用泵頭的排水孔不停的用10%甲醇/水的混合溶劑沖洗柱塞桿；（5）不讓水和腐蝕性溶劑滯留在泵中；（6）定期更換墊圈；（7）加潤滑油。處于良好操作狀態(tài)的泵，應(yīng)該使色譜圖上的基線平穩(wěn)，保留時間的重復(fù)性良好。等度洗脫時壓力波動小于±2%。梯度洗脫時壓力變化應(yīng)是緩慢和平穩(wěn)的。3.2常規(guī)準(zhǔn)備工作包括：開通電源，溶劑脫氣，泵頭及溶劑管路除氣泡及泵的啟動。3.2.1接通系統(tǒng)電源，控制器開通后進(jìn)行自檢，數(shù)秒后通過，接受操作指令。3.2.2溶劑瓶脫氣打開四通道在線過濾器，脫氣15min。3.2.3系統(tǒng)中氣泡的排除泵啟動時，調(diào)節(jié)所需要的通道流速為1ml/min，該通道如A調(diào)節(jié)為100%。將抽液閥旋至draw位，用針筒抽A液10ml，將抽液閥旋至inject位，并推出針筒中的液體，將抽液閥旋至run位。此時參比閥排出的液體應(yīng)連續(xù)，如不連續(xù)則重復(fù)以上抽液排液操作。重復(fù)以上操作分別抽取B，C，D液10ml。將流速減小至0.2ml/min，將參比閥關(guān)閉。柱前氣泡如不能排除，則管路在不與色譜柱連接的情況下，提高流速至9ml/min，數(shù)分鐘后將流速減至1ml/min。3.3等度（Isocratic）操作按direct鍵，進(jìn)入isocratic菜單。依次設(shè)定流路配比，氦氣流速，柱溫。設(shè)定方法如下：按光標(biāo)移動鍵，至閃爍光標(biāo)出現(xiàn)在所需設(shè)定位置上。用數(shù)字鍵設(shè)定數(shù)值，按enter鍵確認(rèn)，注意每個流動相其組成之和應(yīng)為100%，設(shè)定流速為0.1ml/min，逐漸增加流速至實驗所需的流量，待系統(tǒng)平衡后開始實驗。3.4梯度（Gradient）洗脫操作梯度洗脫需要編制梯度表和程序事件（Programevent）表，在OPERATEGRADIENT屏幕時運行。按programmethod鍵，進(jìn)入梯度編輯窗口。移動光標(biāo)鍵至table#處，輸入數(shù)字鍵(1-15)，按enter鍵，將光標(biāo)移至梯度表第一行，依次輸入流速和流量配比，分別按enter鍵確認(rèn)。光標(biāo)移至第二行，依次輸入梯度時間，流速，配比及曲線號(1-11)，重復(fù)以上操作，至梯度表全部編完，按顯示屏對應(yīng)功能鍵save，并記住table#。按Programevent鍵，進(jìn)入程序事件表的編制，移動光標(biāo)鍵至table#處，輸入數(shù)字鍵(1-15)，按enter鍵，將光標(biāo)移至事件表第一行，依次輸入事件號(1-10)和開關(guān)，按enter鍵確認(rèn)，光標(biāo)移至第二行，依次輸入事件時間，事件號，和開關(guān)，按enter鍵確認(rèn)，重復(fù)以上過程至事件表完成，按save鍵儲存。3.5梯度程序的運行按operatemethods鍵，進(jìn)入梯度方法運行窗口，將光標(biāo)移至table處，輸入欲運行的表號(1-15)，按顯示屏對應(yīng)功能鍵startrun，運行。在設(shè)置時，如有疑問，可用HELP提示每個設(shè)置的含義。3.6實驗結(jié)束對泵進(jìn)行沖洗后，關(guān)閉流量，注意流速必須要逐步變化。沖洗順序:如果使用有緩沖液的流動相，則停泵前一定要用HPLC級純水清洗HPLC系統(tǒng)。同時用清水清洗柱塞桿。若停泵存放時間超過一天，則停泵前還需用水/甲醇清洗系統(tǒng)。3.7關(guān)閉電源開關(guān)。4進(jìn)樣4.1采用7725i手動進(jìn)樣器，進(jìn)樣環(huán)（loop）體積為20μl，上樣量在10~20μl時，進(jìn)樣體積必須大于loop體積的3-5倍，才能得到好的重現(xiàn)性，上樣量小于10μl時，可以用10μl的微量進(jìn)樣器直接進(jìn)樣。進(jìn)樣后，快速旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣器的把柄，直接把樣品進(jìn)到色譜柱的柱頭。4.2在做標(biāo)準(zhǔn)曲線時，進(jìn)樣濃度應(yīng)由低到高。5信號檢測及數(shù)據(jù)處理5.1本系統(tǒng)用996型二極管陣列檢測器，波長范圍在190-800nm，接受全波長光譜。在分析過程中測定吸收信號由計算機(jī)進(jìn)行處理，顯示色譜圖或光譜圖，列出數(shù)據(jù)處理結(jié)果。測量結(jié)束時按規(guī)定退出程序后關(guān)機(jī)。5.2點燈，指示燈亮。診斷，檢查校準(zhǔn)。狀態(tài)燈點亮，處于準(zhǔn)備狀態(tài)。穩(wěn)定1小時后可以用于采集數(shù)據(jù)。5.3常規(guī)準(zhǔn)備工作按色譜儀、檢測器、打印機(jī)及計算機(jī)順序接通電源。5.4進(jìn)入Millennium32菜單，按Login，輸入UserNameandPassWord后，按OK。5.5按ConfigureSystem進(jìn)入子菜單，在建NewchromatographySystem，先刪舊的，單擊Project，建NewchromatographySystem，選擇所需要的W600，及檢測器（PDAorELSD）,輸入SystemName，按Finish。5.5使用RunSample窗口可采集處理和報告數(shù)據(jù)5.5.1從Millennium32登錄窗口，雙擊RunSample。5.5.2從RunSample對話框，選擇色譜系統(tǒng)并單擊確定，將建立BusLAC/E連接。5.5.3從菜單條中選擇Edit>NewMethodSet單擊Yes。5.5.4單擊NewCreate以創(chuàng)建新儀器方法。屏幕上顯示EditInstrumentMethod。單擊各儀器。以編輯儀器參數(shù)，然后選擇File>SaveAs以命名、標(biāo)記（約束應(yīng)用環(huán)境）并保存方法。然后選擇File>Exit。5.5.5出現(xiàn)SelectInstrumentMethod對話框。選擇剛剛創(chuàng)建的方法，然后單擊Next。向?qū)⑻崾居脩糨斎脒m用于方法的信息。5.5.6MethodSetEditor對話框?qū)⒊霈F(xiàn)。核實信息，然后選擇File>Exit。5.5.7在RunSample對話框中，單擊Sample選項卡，在樣品表中輸入樣品信息。使用水平滾動條訪問每行中的所有信息。5.5.8單擊工具條上的（Amounts），為各標(biāo)準(zhǔn)樣品瓶輸入組份名稱和濃度。選擇File>Exit，返回RunSample。5.5.9核實運行模式是否設(shè)置成RunAndProcess或RunAndReport。如有必要，使用下拉列表更改該條目。5.5.10選擇File>SaveSampleSetMethod以保存方法。5.5.11使用IntrumentMethod下拉列表選擇儀器方法。單擊設(shè)置。5.5.12要收集數(shù)據(jù)，請單擊工具條上的（綠燈）。5.6使用處理向?qū)?chuàng)建處理方法5.6.1從Millennium32登錄窗口，雙擊BrowseProject。選擇要使用的Project5.6.2單擊通道選項卡，然后單擊工具條上的（Review）。出現(xiàn)查看屏幕。5.6.3單擊工具條上的（ProcessMethodWizard），然后單擊確定。從下拉列表中選擇適當(dāng)?shù)奶幚眍愋停缓髥螕舸_定。向?qū)⒁龑?dǎo)您逐步完成積分和校正參數(shù)的設(shè)置。要在處理方法中輸入某組份的多個濃度，或給它添加高級積分，請選擇View>處理方法布局5.6.5選擇File>SaveAs>MethodSet，將該處理方法保存為方法組的一部分。5.7查看結(jié)果5.7.1在Project窗口中，單擊Result選項卡5.7.2加亮顯示感興趣的樣品（未知樣或標(biāo)準(zhǔn)樣），然后單擊Review圖標(biāo)。查