草莓重茬病菌的分離鑒定

草莓重茬病菌的分離鑒定

“重農(nóng)病”是指同一地塊內(nèi)連續(xù)種植相同品種的育種、第二階段后的生長發(fā)育不良和病，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降的現(xiàn)象。草莓重茬地發(fā)病率可達(dá)89.2%,目前主要采用溴甲烷熏蒸的方法進(jìn)行防治,造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。有報(bào)道指出,草莓重茬病的發(fā)生是由于土壤微生態(tài)環(huán)境惡化造成的,因此,有針對地研制土壤微生態(tài)調(diào)節(jié)劑,從調(diào)控土壤微生態(tài)環(huán)境入手解決草莓重茬病可能是一種很有研究前景的控制措施。目前,許多學(xué)者進(jìn)行了利用微生物防治草莓重茬病害的研究,但是國內(nèi)外尚無利用木霉防治草莓重茬病害的報(bào)道。木霉(Trichoderma)是一類分布廣泛、具有重要利用價(jià)值的拮抗性土壤習(xí)居真菌,對多種病原菌具有拮抗作用。本研究的目的是對草莓主產(chǎn)區(qū)連作地塊的重茬病菌進(jìn)行分離鑒定并研究木霉對草莓重茬病的防治效果。1材料和方法1.1材料表面1.1.1草莓品種的選擇草莓病株從河北省8個(gè)草莓連作區(qū)選取,田間試驗(yàn)采用豐香品種的草莓;菌種:鐮刀菌(Fusarium)、立枯絲核菌(Rhizoctonia)草莓病株上分離,T42木霉(Trichoderm)本試驗(yàn)室分離保存。1.1.2國際h4-2so4模型葡萄糖,分析純,石家莊試劑廠;瓊脂,分析純,SanlandInternationalInc;(NH4)2SO4,分析純,北京化工廠;KH2PO4,分析純,天津市化學(xué)試劑六廠;CaCO3,分析純,石家莊試劑廠;蔗糖,分析純,上海試劑總廠。1.1.3儀器生化培養(yǎng)箱。1.1.4發(fā)酵培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基用于病原菌的分離及平板抑菌試驗(yàn),木霉的液體發(fā)酵培養(yǎng)基為:麩皮0.5,(NH4)2SO40.2,KH2PO40.1,CaCO30.1,蔗糖1,水1000,pH5.5～6.0。木霉制劑:由木霉發(fā)酵物輔以適量草炭。1.2方法1.2.1消毒時(shí)間取所取發(fā)病植株根部,70%酒精表面消毒2min,0.1%升汞消毒1min,無菌水沖洗3次。取病健交界處,剪成長度0.3cm小段,放入盛有PDA培養(yǎng)基的平皿中,每皿3段,25℃恒溫培養(yǎng),待菌落長出后,統(tǒng)計(jì)各菌落出現(xiàn)頻率,純化并進(jìn)行分類鑒定。1.2.2草莓苗病害觀察方法:對所分離病原菌進(jìn)行純化培養(yǎng),將培養(yǎng)物制成108cfu/ml的孢子懸浮液,將草莓苗根部在其中浸泡15min,然后栽入直徑為15cm盛有等量滅菌土的花盆中,每處理10次重復(fù),溫室培養(yǎng)30d,觀測并記錄其發(fā)病情況。1.2.3木霉t-pda平板制備將活化的木霉斜面菌種接種于木霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基,于28℃、250r/min搖床,培養(yǎng)72h。木霉發(fā)酵液4000r/min離心20min,取上清液。在倒PDA平板之前,將原液、10倍稀釋液、100倍稀釋液按1∶10的比例與PDA培養(yǎng)基混合,然后將直徑0.9cm病原菌菌塊接入平板的邊緣,以加入清水的培養(yǎng)基為對照。測量對照中病原菌菌落滿板時(shí),各處理的菌落半徑。1.2.4田間實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)在欒城縣范臺村,分別于2002～2003年度、2003～2004年度兩個(gè)年度同時(shí)進(jìn)行盆栽和田間實(shí)驗(yàn),連作土為對照,以木霉菌劑(15g/kg土)為處理。每處理3次重復(fù),田間實(shí)驗(yàn)隨機(jī)排列,小區(qū)面積20m2,栽培管理與田間相同。草莓生育期間測定不同生育時(shí)期的草莓株高、莖粗、草莓開花時(shí)期、草莓果數(shù)、果重及生物量。2結(jié)果與分析2.1牧草重農(nóng)病原生植物的分離與測定2.1.1單梗雙胞霉、擬盤多毛孢分離頻率表2列出了分離頻率較高的5種真菌,通過對菌落生長速度、培養(yǎng)性狀、色澤、產(chǎn)孢類型、菌絲形態(tài)等測定及觀察,鑒定5種真菌分別為Fusariumoxysporun(尖孢鐮刀菌)、Rhizoctoniasolani(立枯絲核菌)、Verticilliumdahliae(大麗輪枝菌)、Didymariacda.spp(單梗雙胞霉)、Pestalotiopsissteyspp.(擬盤多毛孢),從表2可以看出,盡管不同地塊的分離結(jié)果有一定差異,但均以鐮刀菌和絲核菌的分離頻率比較高,而單梗雙胞霉、擬盤多毛孢不同地塊的分離頻率差異很大。表3列出五種真菌對草莓致病性測試結(jié)果,鐮刀菌、絲核菌和輪枝菌均能浸染草莓,引起病害,植株癥狀和田間病株一致,并且從發(fā)病植株根部能再分離獲得與接種物相同的培養(yǎng)物,說明這三種菌為草莓重茬病的主要病原菌,其他兩種真菌不能浸染草莓,可能是由于他們具有腐生于草莓病根的能力,所以在有些地塊也具有較高的分離頻率。2.2木霉t42發(fā)酵汁的抑制率由表4可知,T42木霉發(fā)酵液對立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用,其中10倍T42木霉發(fā)酵液對立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌的抑制率分別為87.8%、85.3%,1000倍的抑制率也能達(dá)到37.0%和31.0%。由此表明,T42木霉對病原菌有明顯的拮抗作用,可以作為潛力生防菌株。2.3木霉菌涂料對雙重田園感染的稻草栽培的預(yù)防2.3.1木霉對不同濃度木霉處理的生長情況木霉菌劑對草莓生長有一定的促進(jìn)作用,由圖1可以看出,木霉處理的株高、莖粗、生物重等指標(biāo)均優(yōu)于重茬對照。分析推知,木霉能夠?qū)Σ≡纳L繁殖起到抑制作用,從而減輕其對草莓的危害,有利于連作草莓的生長發(fā)育。2.3.2對草莓死苗率的影響第一批果實(shí)采收之后,由于植株體內(nèi)營養(yǎng)消耗增多,造成營養(yǎng)供應(yīng)不良出現(xiàn)死苗是草莓重茬病的重要病癥。由圖2可知,連作土壤中施入木霉菌劑明顯降低了連作草莓的死苗率,草莓第一批果采收之后,對照和處理都出現(xiàn)了死苗現(xiàn)象。顯著性分析表明,連作處理死苗率52.9%極顯著地高于木霉處理,表明木霉菌劑施于土壤,可減輕草莓重茬死苗的發(fā)生,起到控制重茬病害的作用。2.3.3開花期、收獲期提前表5列出不同處理草莓的重要生育期,從表中可以看出,木霉處理能夠使連作草莓的生育期提前,其中開花期提前4天、收獲期提前6d。由表6可知,施入木霉不僅使重茬草莓的收獲期提前還能夠增加草莓的產(chǎn)量,顯著性分析表明,總產(chǎn)量之間存在極顯著差異。3土壤微生態(tài)調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)通過對連作草莓根部真菌病害的研究,證實(shí)了草莓重茬病主要是由3種病原真菌單獨(dú)或復(fù)合侵染引起的,經(jīng)進(jìn)一步鑒定3種病原真菌分別為:FusariumoxysporumSchl.f.sp.fragariaeWiinksetWillams、RhizoctoniasolaniKuhn、VerticilliumdahliaeKelb。在河北省草莓產(chǎn)區(qū)以鐮刀菌和絲核菌的單獨(dú)和復(fù)合侵染為主。草莓重茬病發(fā)生的原因,可能是由于連作條件下草莓根系分泌物或殘茬腐解物在土壤中逐年積累,這些物質(zhì)為土壤中病原真菌的繁殖提供了條件,使其種群數(shù)量增加,最終導(dǎo)致病害嚴(yán)重發(fā)生。目前,草莓重茬病害主要利用溴甲烷進(jìn)行防治,溴甲烷被禁用后用何種方法控制草莓重茬病害是當(dāng)前亟待解決的重要問題。甄文超等人研究表明連作土壤微生物種群變化的原因應(yīng)是草莓再植病害發(fā)生的主要原因之一,因此利用土壤微生態(tài)調(diào)節(jié)劑,從調(diào)控土壤微生態(tài)環(huán)境入手解決草莓重茬病可能是一種很有研究前景的控制措施。馬寶紅等報(bào)道兩種VAM菌對草莓病害有明顯的防效,高志華等人利用叢枝菌根菌與太陽熱消毒配合對連作草莓病害進(jìn)行防治,相對防效達(dá)53.31%。而徐淑