甜瓜枯萎病防治反應及相關酶活性的變化

甜瓜枯萎病防治反應及相關酶活性的變化

土壤養(yǎng)殖的風險和南瓜萎縮，對生產和工業(yè)的危害十分嚴重。木霉(Trichodermaspp.)是一類普遍存在、已被廣泛應用的生防因子。它能對多種病原菌產生拮抗作用,有效地抑制病原菌生長。植物內生細菌由于定殖于宿主體內,有充足的營養(yǎng)來源,不易受外界逆境因子影響,與其它根際細菌、葉際附生細菌相比,其特定的生存環(huán)境更利于發(fā)揮生防作用,因而成為近年來倍受人們關注的生防因子。研究者們已經從棉花、馬鈴薯、辣椒、玉米等植物中分離出大量的內生細菌,并對內生細菌的生防機制作了研究。但有關拮抗木霉和植物內生細菌結合防治的研究卻不多見。本試驗在溫室內應用拮抗內生細菌與木霉復合處理甜瓜,從防御酶系的變化分析其誘導甜瓜抗病性的生防機制。1材料和方法1.1綠色木霉屬viruspo型甜瓜品種為“齊甜一號”。枯草芽孢桿菌[Bacillussubtilis(Ehrenberg)Chon(1872)]B6菌株自甜瓜組織內分離,綠色木霉(TrichodermaviridPers.exS.F.Gray)T23、甜瓜枯萎病菌[Fusariumoxysporumf.spmelonis(Leach)Syn]F由沈陽農業(yè)大學生物防治工程中心提供。1.2內生細菌多樣性測定木霉T23在麥麩培養(yǎng)基(麥麩與水按質量分數約1∶1混合,121℃濕熱滅菌45min)中25℃恒溫培養(yǎng)10~14d后,風干粉碎,以1∶100比例與滅菌土混合。甜瓜枯萎病菌F在玉米粉砂土培養(yǎng)基(玉米粉1000g,洗凈的砂1000g,水1500ml)中25℃培養(yǎng)10~14d,風干粉碎,以0.5∶100與滅菌土混合。內生細菌B6在LB培養(yǎng)液中30℃振蕩(120r/min)培養(yǎng)48h,制成濃度約2×107cfu/ml的菌懸液。常規(guī)種子消毒處理,待芽長約1cm左右時播種。種子播種在滅菌土中,待甜瓜長出3片真葉后,進行接種。用注射器將菌懸液注入植株根圍土壤,單獨接種的處理每株接種10ml,復合接種的處理B6與T23各5ml,設清水為對照。試驗設:①接種F;②接種F和T23;③接種F和B6;④同時接種T23、B6和F,共4個處理。每處理80盆,每盆播2粒種子,每處理3次重復。放入溫度約25℃的溫室中培養(yǎng),三葉期調查記錄發(fā)病情況。1.3例如，b2和b23的組合使用對瓜氨酸反應反應酶系統的影響1.3.1制備抗血球計數板上的藥物T23和病原菌F在PD液體培養(yǎng)基中28℃振蕩(120r/min)培養(yǎng)7~10d,血球計數板調整孢子濃度,制成5×106cfu/ml(T23)和1×106cfu/ml(F)的孢子懸液。1.3.2接收點3和s13種子處理和接種方法同1.2。誘導接種后72h挑戰(zhàn)接種F菌株,試驗共設8個處理:①CK(自來水);②接種T23;③接種B6;④接種T23后,挑戰(zhàn)接種F(T23+F);⑤接種B6后,挑戰(zhàn)接種F(B6+F);⑥同時接種T23和B6(T23+B6);⑦同時接種T23和B6后,挑戰(zhàn)接種F(T23+B6+F);⑧單獨接種F。1.3.3不接種、挑戰(zhàn)接種f的處理取甜瓜根用自來水快速沖洗后,用濾紙吸干,每個樣品稱取1g裝入自封袋,放入-70℃超低溫冰箱中保存。每個處理3次重復取樣。不接種F菌株的處理從接種后開始每隔48h取一次樣,至接種后的第8d;挑戰(zhàn)接種F的處理從接種F菌株后每隔48h取一次樣,至挑戰(zhàn)接種的第8d。將上述稱取的樣品,放入預冷的研缽中,加入3ml硼酸緩沖液(含有少量巰基乙醇)和少量石英砂,冰浴研磨成勻漿,轉移至離心管中,10000r/min、4℃離心20min,所得上清液即為酶的粗提取液,4℃保存。1.3.4酶法制備酶系統,-1,3-葡聚糖酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)以L-苯丙氨酸為底物,按賈顯祿的方法測定,有改動;過氧化物酶(POD)以愈創(chuàng)木酚為底物,參照陳捷等的方法測定;多酚氧化酶(PPO)以鄰苯二酚為底物,參照李靖等的方法測定;β-1,3-葡聚糖酶以葡聚糖為底物,按高增貴、賈顯祿方法測定。酶粗提液及未知樣蛋白含量的測定參照Broadford方法,用考馬斯亮藍G-250法測定酶粗提液中的蛋白含量,以牛血清白蛋白作標準曲線。2結果與分析2.1不同菌株單獨和復合處理對抗性相關系數的影響在溫室內,B6和T23復合處理對甜瓜枯萎病的相對防效達82.22%,而B6菌株和T23菌株單獨處理相對防效分別為61.90%和33.33%,復合處理比單獨處理分別高32.8%和146.7%(表)。2.2不同復合接種對甜瓜根系pod活性的影響2.2.1PAL活性T23、B6、T23+B6誘導接種甜瓜幼苗后,PAL活性高于對照,但各處理間差異不大(圖1A)。單獨接種T23后酶活性逐漸上升,8d峰值達到2548.83U/g;單獨接種B6后,在2d出現一個酶活性高峰,后緩慢下降,于8d再次升高;T23與B6同時接種的處理,其變化趨勢與B6單獨處理相類似,但在6~8d活性稍高于單獨使用B6的處理。與之相比,接種F各處理的PAL活性出現了較大的變化(圖1B)。單獨接種F,PAL活性始終低于對照,且在前6d一直下降,8d時稍有回升;先接種T23,再挑戰(zhàn)接種F后,活性逐漸升高,于6d達高峰,為1914.05U/g,之后下降;先接種B6再挑戰(zhàn)接種F的處理酶活性先升高后下降,但其峰值變化不大;只有先接種T23和B6,再挑戰(zhàn)接種F的處理,在接種后的2d即出現一個明顯高于對照的峰值,為2290.12U/g,緩慢升高后,于8d再次出現一個更加明顯的大峰,其峰值為4162.87U/g,高出對照約4倍。從上述結果可以看出,T23和B6復合使用對PAL活性增強的影響要比兩者的單獨使用明顯,尤其在挑戰(zhàn)接種F后,兩者復合使用對PAL活性上升的幅度要比單獨使用高,持續(xù)時間更長。2.2.2POD活性如圖2A所示,在不接種F的處理中,甜瓜根系POD活性在復合接種B6與T23后的第2d顯著上升,出現酶活性高峰達1197.27U/g,之后有所下降,8d時又有所回升,其峰值為1180.14U/g;單獨接種B6的處理酶活性2~6d內平穩(wěn)上升,變化不大,8d突然升高,峰值達1735.97U/g,高于其它處理;單獨接種T23后,POD活性變化不是十分明顯,8d峰值達805.93U/g。相比之下,復合接種T23與B6,再挑戰(zhàn)接種F,其POD活性變化十分顯著,第2d就出現一個酶活高峰,稍有下降后又繼續(xù)升高,到接種后8d,POD活性峰值達1931.99U/g,高出對照約10倍;接種B6后的處理在4d達活性高峰之后就開始下降,8d峰值達311.86U/g;接種T23后挑戰(zhàn)接種F的處理在6d出現一個酶活性高峰達685.84U/g,之后有所下降(圖2B)。由此可見,盡管在不接種F和接種F的各個處理中,B6和T23單獨接種對POD活性上升有促進作用,但在挑戰(zhàn)接種F之后,復合接種對POD活性上升的影響還是高于單獨接種。2.2.3PPO活性不接種F的各個處理,PPO活性變化范圍在439.85~679.64U/g之間(圖3A)。接種F的各個處理中(圖3B),單獨接種F的處理于2d即出現一個明顯的峰,峰值達760.85U/g,比對照高1.5倍,之后急驟下降,然后又稍為上升,但幅度不大,第8d酶活性達512.78U/g;接種T23后,挑戰(zhàn)接種F的處理,在接種后2d酶活性下降,且低于對照,之后逐漸上升,8d達高峰,酶活性達831.14U/g;B6+F的處理其PPO活性始終低于對照,呈下降趨勢;但B6和T23復合接種后再挑戰(zhàn)接種F,PPO活性急驟上升,明顯高于其他處理,8d達1040.91U/g,明顯高于對照463.94U/g。說明挑戰(zhàn)接種F比不接種F對甜瓜根系PPO活性的影響大,而且在挑戰(zhàn)接種F的處理中,T23和B6復合接種對PPO活性上升在接種后的8d之內有持續(xù)的促進作用。2.2.4β-1,3-葡聚糖酶活性B6與T23復合接種后,β-1,3-葡聚糖酶活性急驟升高,是對照的5倍,第4d稍有下降,6~8d趨于平穩(wěn),酶活性變化較其他處理明顯;B6單獨接種后,酶活性較高,8d達78.33U/g;接種T23后,酶比活性變化趨勢稍低于對照。挑戰(zhàn)接種F后,β-1,3-葡聚糖酶活性變化趨勢與不接種F的變化趨勢相類似(圖4)。由此可以看出B6和T23復合接種能明顯誘導甜瓜根系β-1,3-葡聚糖酶活性的增強。3木霉與內生細菌的復合誘導抗性多年來國內外學者對木霉的生防應用、生物藥劑開發(fā)以及生防機制做了許多嘗試和深入的研究,并相繼有商品化木霉制劑問世。其生防機理主要是木霉對病原菌有拮抗作用,可阻止病菌侵染,然而病菌一旦進入根系維管束便很難防治。此外高溫、干燥、化學農藥、化肥、重金屬等逆境因子能干擾木霉在土壤內的活性,而且對其在作物根表的定殖有明顯抑制作用。本研究應用內生枯草芽孢桿菌與綠色木霉復合處理防治甜瓜枯萎病,以彌補只能定殖于根表拮抗木霉的不足。通過溫室試驗的研究證明了木霉與內生細菌復合處理可提高對甜瓜枯萎病的防治效果。植物誘導抗性的機制是多方面的,其中包括了與木質素形成有關的苯丙烷類代謝途徑中有關酶活性的增加、植保素的合成以及病程相關蛋白(PRs)等多種生理生化因子。其中PAL、酚類氧化或縮合的POD、PPO、β-1,3-葡聚糖酶是植物防御反應的重要酶系,成為國內外許多學者在寄主與病原互作過程中評價植物抗病性的重要生理指標,尤其PAL是酚類物質、植保素和木質素合成的關鍵酶,植物在受到病原菌侵染或激發(fā)子刺激后PAL活性會首先上升。焦琮等用康氏木霉處理棉花和菜豆幼苗后,過氧化物酶活性提高。Elad等利用哈茨木霉T39接種根部或葉子后,控制了灰葡萄孢引起的病害,認為誘導抗性是重要機制之一。夏正俊等從棉花內分離出