木霉防治植物立枯病的初步研究

木霉防治植物立枯病的初步研究

定向育苗病是指在育苗階段由各種真菌引起的土壤傳播疾病，發(fā)生在不同的地區(qū)，危害嚴重，難以控制。多年的化學預防使細菌對各種殺菌劑和土壤消毒劑產(chǎn)生了抗藥性，抗藥性發(fā)展速度驚人，導致化學農(nóng)藥的使用劑量增加，農(nóng)藥殘留增加，土壤生物結構受到破壞。因此,相對安全的生物防治越來越引起人們的關注。木霉(Trichoderma)作為最重要的生物防治因子在國內外被廣泛研究,用木霉制劑防治植物病害具有對人畜無毒、產(chǎn)品無農(nóng)藥殘留、不污染環(huán)境等優(yōu)點,木霉不僅對植物病原真菌具有拮抗效應,還能促進植物營養(yǎng)吸收、提高植物生長和生物量。目前,應用木霉菌劑在林業(yè)、藥用植物、農(nóng)業(yè)以及花卉病害的生物防治中均取得了顯著效果,并且世界上有多種木霉商品化菌劑問世,在生物防治藥劑市場占據(jù)重要地位。本研究對從以色列耶路撒冷希伯來大學農(nóng)學院引進的6株木霉菌株進行了篩選,將高效菌株制備生物菌劑對針葉苗木立枯病進行了室外防治試驗。1材料和方法1.1高效木霉菌株的引進供試木霉(Trichoderma)菌株8株,其中T-13、T-19、T-43、T-35、T-28、T-203為從以色列引進高效菌株,T-C14、T-C33為東北林業(yè)大學森林微生物實驗室保存的高效菌株,具體菌株信息見表1。苗木立枯病病原菌為立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、腐皮鐮刀菌(Fusariumoxysporum),東北林業(yè)大學森林微生物實驗室保存。1.2競爭系數(shù)及抑菌率測定采用平板對峙培養(yǎng)法,每個處理3次重復。在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每8h測量1次菌落直徑,測量48h,計算抑菌率、生長速度及相對抑制效果,并對對峙拮抗線進行觀察和描述,統(tǒng)計競爭系數(shù),每個處理3次重復。對峙培養(yǎng)中競爭系數(shù)分級標準:Ⅰ級.木霉菌絲占據(jù)平板100%;Ⅱ級.木霉菌絲占據(jù)平板2/3以上;Ⅲ級.木霉菌絲占據(jù)平板1/3~2/3;Ⅳ級.木霉菌絲占據(jù)平板1/3以下;Ⅴ級.病原菌菌絲占據(jù)平板100%。記錄48h后病原菌和木霉菌菌落之間的關系。抑菌率=[(對照菌落半徑-對峙培養(yǎng)菌落半徑)/對照菌落半徑]×100%。相對抑制效果=病原菌株被抑制率/拮抗菌株被抑制率。1.3生長抑制率測定非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的制備:將木霉菌株接種到PDA平板上活化3d,用0.5cm打孔器取3片菌餅,接種到300mLPD培養(yǎng)基中,25℃,150r/min,恒溫振蕩培養(yǎng)7d,用8層紗布過濾菌絲,制成木霉發(fā)酵液原液,減壓旋轉蒸發(fā)將發(fā)酵液濃縮到原體積的1/10,備用。抑菌活性測定:采用菌絲生長抑制法,將制備好的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物添加到PDA培養(yǎng)基中,搖晃均勻,使終濃度達到20%,倒平板,待冷卻凝固后,接入病原菌,以不添加代謝產(chǎn)物的PDA平板作對照,25℃恒溫培養(yǎng)5d,采用十字交叉法測量病原菌的菌落直徑,計算木霉非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌生長的抑制率,每個處理3次重復。抑菌率=[(對照菌落半徑-抑制培養(yǎng)菌落半徑)/對照菌落半徑]×100%。1.4生長抑制率測定采用對扣培養(yǎng)法測定,將木霉在90mm平皿上培養(yǎng)2d后,去掉皿蓋,扣上接有病原菌菌片的平皿,放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中,倒置培養(yǎng)。以僅接種病原菌的培養(yǎng)皿為對照。每天觀察病原菌和木霉菌絲的生長狀況,對扣培養(yǎng)5d后采用十字交叉法測量病原菌的菌落直徑,計算木霉揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌生長的抑制率,每個處理3次重復。抑菌率=[(對照菌落半徑-抑制培養(yǎng)菌落半徑)/對照菌落半徑]×100%。1.5制備菌種、培養(yǎng)基、灌根經(jīng)過高效菌株篩選,選擇T-43制備生防菌劑進行室外防治紅松、落葉松和云杉的一年生苗木立枯病,同時以T-C14作為對照。其中,紅松、落葉松防治在黑龍江省葦河林業(yè)局西林苗圃進行,云杉防治在黑龍江省帶嶺林業(yè)局西苗圃進行,防治時間為2011年5月5日和25日分2次進行。菌劑制備方法:孢子懸浮劑,將木霉菌株接種到PDA平板上,25℃恒溫培養(yǎng)7d,用無菌水沖洗孢子,用血球計數(shù)板計算濃度,稀釋制備3.5×109個/mL,4℃保存?zhèn)溆?液體菌劑,將木霉菌株接種到PDA平板上,25℃恒溫培養(yǎng)5d,用無菌水沖洗孢子,制備成104個/mL備用。制備PD培養(yǎng)基,121℃滅菌20min,冷卻后接入木霉孢子液1mL,25℃恒溫振蕩培養(yǎng)7d,4℃保存?zhèn)溆?。防治方?采用灌根法,將2種菌劑分別設置4個濃度梯度,共16個處理,同時以空白(清水)、多菌靈(50%可濕性粉劑)800倍以及牛博士1000倍(木霉孢子可濕性粉劑)作為對照,共計19個處理,分別澆灌到一年生苗根部,每個處理2次重復,連續(xù)防治2次。防治效果調查:30d后測定苗木的生長量(苗高、根長、全株高)、生物量(濕重、干重),并調查發(fā)病率,計算防治效果,使用SPSS軟件計算顯著性差異。2結果與分析2.1對腐皮刀菌的抑制率平板對峙培養(yǎng)結果表明,不同木霉菌株對絲核菌和鐮刀菌的拮抗作用差異明顯,對絲核菌相對抑制率較高的為T-13和T-43(表1),相對抑制效果分別為3.3和2.7,對腐皮鐮刀菌的相對抑制率均約為1。在對峙培養(yǎng)中,木霉菌可有效抑制病原菌的生長,形成明顯拮抗線,其中T-13、T-19菌絲可以越過病原菌繼續(xù)生長,直至完全覆蓋病原菌菌落,而T-43、T-28和T-C14在菌落交接處形成顏色較深的拮抗線,病原菌菌絲生長稀疏,T-203菌絲生長速度較慢,對絲核菌和鐮刀菌的拮抗效果較弱,對病原菌菌絲生長的抑制作用不明顯。2.2木霉代謝產(chǎn)物的抑菌活性木霉的生防作用包括競爭作用、重寄生作用、產(chǎn)生抑菌活性成分。木霉可產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物,其中包括抑菌活性成分,可以抑制其他真菌的生長,通過混合培養(yǎng)基法和對扣培養(yǎng)法分別測定了木霉的非揮發(fā)和揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對立枯絲核菌和腐皮鐮刀菌生長的抑制作用(表2)。試驗結果表明,代謝產(chǎn)物抑菌作用明顯的菌株有T-43、T-13和T-C14,對絲核菌和鐮刀菌的抑制率均>70%,其中T-43代謝產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性較好,滅菌處理后,仍然具有很高的抑菌活性,病原菌在含有活性成分的培養(yǎng)基上菌絲生長稀疏,氣生菌絲較多。揮發(fā)性代謝產(chǎn)物抑菌率普遍偏低,其中對絲核菌生長幾乎沒有抑制作用。2.3室外育苗和繁殖試驗2.3.1木霉菌劑防治效果木霉作為世界公認的高效生防菌株,在防治土傳病害中作用明顯,并且在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已經(jīng)得到推廣應用,并推出多種木霉商品化菌劑,在林業(yè)苗圃中應用研究還處于空白狀態(tài),本研究通過灌根防治立枯病,二次防治30d后,木霉菌劑對立枯病具有明顯的防治效果(表3),不同濃度菌劑處理防治效果差異顯著,對于落葉松苗木,T-C14+T-43的孢子菌劑30倍液處理防治效果達到88.6%,僅次于化學藥劑多菌靈800倍液處理;對于紅松苗木,單獨使用T-43孢子菌劑1倍液、10倍液和30倍液灌根處理,可以達到80%以上的防治效果;對云杉,單獨使用T-43孢子菌劑30倍液灌根處理,防治效果最高,到88.63%?？傮w評價,引進菌株T-43在室外立枯病防治試驗中表現(xiàn)良好,可以在土壤中迅速定植,并表現(xiàn)出較高的病害控制能力。2.3.2木霉劑處理對苗木生長和抗逆性的影響木霉可以代謝出多種生長素類物質,對促進植株生長具有明顯的促進作用。本試驗結果表明,木霉灌根30d后,對3種針葉苗木均有顯著的促生作用,植株高、生物量等指標均明顯增加(圖1~3)。與孢子懸浮液相比,液體菌劑在促生作用方面更具優(yōu)勢,其中10倍液、30倍液處理,苗木長勢最好,在株高生長上,與對照相比,木霉菌劑處理30d后,苗木可以增加15%的生長量,濕重和干重的生物量約增加80%。同樣株高的苗木,更加粗壯,抗病和抗逆能力更強,50倍液與對照差異不顯著,而1倍液處理,由于濃度過高,對植株的生長會起到副作用。木霉對植物具有促生抗逆的作用,有研究證明,木霉在促進植物生長和生物量增加的基礎上,還可以誘導植物產(chǎn)生抗逆性,增加紅松和落葉松苗木的總蛋白含量,提高保護酶活性,增加植株的抗逆性,同時增加針葉中的葉綠素含量,對促進光合作用明顯,使一年生苗的生物量增加。與商品化木霉菌劑相比,引進木霉菌株T-43優(yōu)勢明顯,在有效防治立枯病的同時,顯著增加松苗的生物量和株高生長,具有開發(fā)木霉菌劑的優(yōu)勢和潛力。3皮鐮菌的抗性1)通過平板對峙培養(yǎng)和代謝產(chǎn)物抑菌試驗綜合篩選得到可以有效抑制立枯絲核菌和腐皮鐮刀菌的高效木霉菌株T-43和T-C14,在對峙培養(yǎng)中,這2種菌株可有效抑制病原菌的生長,形成明顯拮抗線,并最終覆蓋病原菌菌落,病原菌在含有木霉代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)基上不生長或生長菌落稀疏,氣生菌絲較多,生長受到抑制明顯。2)對立枯病防治的田間試驗中,孢子粉劑和液體菌劑均可以有效地控制多種針葉苗木落葉松、紅松和云杉立枯病的發(fā)生,其中T-43孢子菌劑防治效果好于液體菌劑,在促進植株生長方面,液體菌劑效果明顯。本試驗結果表明,木霉菌株T-43和T-C14對立枯絲核菌和腐皮鐮刀菌具有較強的拮抗作用,其代謝的抑菌活性物質可以有效抑制病原菌的生長,筆者另外的試驗結果證明,這2種木霉菌對其他林木病原菌包括楊樹爛皮病菌(Cytosporachrysosperma)、松枯梢病菌(Sphaeropsissapinea)、沙棘干縮病菌(Fusariumsporotrichioides)、松爛皮病菌(Cenangiumferruginosum)同時具有明顯的拮抗作用,說明這2種木霉菌都是適應性較強的廣譜性拮抗真菌,在林木病害生物防治中具有廣闊的開發(fā)應用前景。木霉菌作為普遍存在并具有豐富資源的拮抗微生物,在植病生防中具有不可替代的地位,目前對木霉菌的篩選、應用研究在各種病害防治中都有相關的研究,并取得了顯著的效果,本試驗中對木霉代謝產(chǎn)物的抑菌活性物質的分離純化有待進一步研究。木霉菌是重要的生防真菌,研究發(fā)現(xiàn)部分木霉菌株可定殖于植物根際,與植物根系形成共生體,改變植物的代謝功能,表現(xiàn)在促進植物生長、增加養(yǎng)分吸收利用效率、提高農(nóng)作物產(chǎn)量以及誘導植物產(chǎn)生抗逆性等方面。木霉菌對植物的促生作用包括增加種子萌發(fā)率、促進出苗、提高根系和莖葉生物量等,如黃瓜接種T.harzianum后,可以增加95%的根系面積并提高根系對微量元素的富集水平。Gravel使用深綠木霉處理番茄,使莖葉和根的干質量增加3倍,并且顯著提高了產(chǎn)量。目前,關于木霉促生作用的研究對象主要