原位雜交具體步驟

原位雜溝通程cDNADNA片段標(biāo)記探針對石蠟切片進(jìn)展mRNA檢測的流程圖。這些試驗操作方法很多參考書中均有但沒有一本書是專為這個目的而系統(tǒng)地加以總結(jié)的因此特加以綜合供同行參考在具體操作過程中很多地方可酌情變更。在臨床應(yīng)用中常常可以買到已經(jīng)標(biāo)記好的商品探針那么前面一大局部擴(kuò)增基因、酶切鑒定、標(biāo)記探針的工作就可以省去從石蠟切片處理做起即可。下面介紹的方法筆者已親自做過數(shù)次可獲滿足結(jié)果。主要操作步驟制備感受態(tài)細(xì)菌用含目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌小量培育轉(zhuǎn)化的細(xì)菌小量提取質(zhì)粒小量酶切質(zhì)粒電泳鑒定大量培育轉(zhuǎn)化的細(xì)菌大量提取質(zhì)粒大量酶切質(zhì)粒電泳分別、回收及純化標(biāo)記探針石蠟切片的處理預(yù)雜交、雜交雜交后處理抗體連接、顯色制備感受態(tài)細(xì)菌【試劑及配制】LB液體培育基900ml三蒸水中參加胰蛋白胨(bacto-tryptone)10g酵母提取物(bacto-extract)5gNaCl10g磁力攪拌使完全溶解用5molNaOH調(diào)整pH至7.0 如用進(jìn)口試劑則不必調(diào)。定容為1000ml 高壓滅菌20min。0.1molCaCl2溶液1.1g無水氯化鈣溶于90ml三蒸水中定容至100ml 用0.22μm濾器過濾除菌置于滅菌中4℃保存?！静牧稀看竽c桿菌單菌落或凍存菌種也可復(fù)蘇陳舊的感受態(tài)細(xì)菌重制備的感受態(tài)?！静僮鞣椒ā繌?7℃培育12 16h的平板中用無菌的接種環(huán)用前酒精燈燒紅晾涼挑一單菌落轉(zhuǎn)入含有5mlLB培育基的無菌試管37℃振搖 200r/min 過夜。次日取菌液1ml參加含100mlLB培育基的500ml錐形燒瓶37℃振搖培育200 300r/min 約2 3h將燒瓶取出馬上置冰浴10 15min以下均為無菌操作。在超靜工作臺中將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個滅過的冰預(yù)冷50ml離心管中4℃離心 5000g×10min 回收細(xì)菌棄去培育液將管倒置于濾紙上1min 流盡培育液0.1molCaCl210ml重懸菌體置冰浴30min4℃離心 5000g×10min 棄上清倒置于濾紙上1min加4ml用冰預(yù)冷的0.1molCaCl2 重懸菌體動作要輕置4℃冰箱12 24h 即可用于轉(zhuǎn)化。感受態(tài)細(xì)菌的凍存1.5mlEP管中沸水浴10min400μm30%體積的甘油充分混勻置-70℃冰箱一年內(nèi)可使用。用含目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌【試劑及配制】LB液體培育基氨芐青霉素Amp 選擇性培育基LB培育基中參加1.5%的瓊脂 15g/L 高壓滅菌20min 取出在無菌條件下冷卻至50℃左右時燒手但尚可忍受參加抗生素或其他必需成分如為氨芐青霉素 Amp50mg/ml50μg/ml的量參加即每ml培育1μl氨基芐。氨芐貯存液將氨芐青霉素鈉溶于三蒸水配成50mg/ml溶液以0.22μm濾紙過濾 1ml一份分裝存于-20℃?！静僮鞣椒ā? 無菌狀態(tài)下取穎感受態(tài)200μl10ml玻璃試管中。假設(shè)使用凍存的感受態(tài)細(xì)菌時將其從-70℃冰箱取出握于手中待其解凍后馬上吸取200μl轉(zhuǎn)移至10ml無菌玻璃試管中剩余的感受態(tài)棄去不能再凍存復(fù)用每管加質(zhì)粒50 100ng 輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物在冰上放置30min42℃水浴熱休克90s 不要搖動試管每管加無抗生素的LB培育基1ml 37℃搖床溫順搖振 100 150r/min45min芐青

用無菌的彎頭玻璃鋪菌器用前酒精燈燒再晾涼將200μl菌液鋪于含氨霉素的瓊脂平板外表37℃放置20min 然后倒置培育14 20h 37℃。小量培育轉(zhuǎn)化的細(xì)菌【操作方法】取滅菌處理的10ml玻璃試管用無菌吸管參加約5mlLB液體培育基再參加50mg/ml5μl用接種環(huán)或無菌牙簽挑取單菌落送入培育液中晃動使細(xì)菌進(jìn)入培育液封好管口37℃搖床100 200r/min 約6 12h 可過夜使生長飽和。質(zhì)粒的少量提取【試劑及配制】溶液Ⅰ葡萄糖 C6H12O6·H2O 1.982g三蒸水160ml0.5molEDTApH8.04ml1molTris-ClpH8.05ml以三蒸水定容至200ml 高壓滅菌4℃保存0.5molEDTApH8.0的配制Na2EDTA·H2O186.1g 175g三蒸水700ml邊磁力攪拌邊參加固體NaOH 緩慢少量參加待充分溶解 pH接近8.0 用酸度計調(diào)整pH8.0 HCl/NaOH1molTris-ClpH8.0的配制Tris堿121g三蒸水800ml充分?jǐn)嚢栌脻恹}酸將pH調(diào)整至8.0 酸度計測量溶液Ⅱ50ml的量現(xiàn)用現(xiàn)配。10molNaOH1ml三蒸水40ml10%SDS5ml50ml10molNaOH的配制40gNaOH100ml10%SDS的配制戴口罩稱10gSDS 溶于80ml三蒸水中68℃助溶加數(shù)滴1molHCl 調(diào)pH7.2100ml1molHCl的配制于通風(fēng)櫥中三蒸水91.4ml 濃鹽酸8.6ml 混勻溶液Ⅲ5mol乙酸鉀60ml冰乙酸11.5ml三蒸水28.5ml高壓滅菌4℃保存5mol乙酸鉀配制200ml乙酸鉀98.14g三蒸水160ml攪拌溶解定容至200ml;3ml乙酸鈉 NaAc pH5.2配制 500ml乙酸鈉 CH3COONa·H2O 201.1g三蒸水200ml用冰乙酸調(diào)整pH為5.2 三蒸水定容至500ml 高壓滅菌4℃保存。平衡酚在粗酚中參加0.1%8-巰基喹啉然后倒入0.1molTris-ClpH8.0 避光磁力攪拌4h靜置后移去水相再加0.1molTris-ClpH8.0 攪拌、去除水相反復(fù)進(jìn)展直到水相pH>7.8時為止裝棕色瓶4℃保存。TE緩沖液pH8.0配制最終使10mmolTris-ClpH8.01mmolEDTApH8.0其它試劑氯仿乙戊醇 V/V=24 1 、無水乙醇、70%乙醇【操作方法】取1ml菌液置于1.5ml的EP管中 10000g×30s離心控盡上清液加溶液Ⅰ100μl 重懸菌體加溶液Ⅱ200μl 倒轉(zhuǎn)均勻加溶液Ⅲ150μl 混勻6 10000g×5min離心EP管加等體積平衡酚混勻室溫離心8000g×5min留神吸取上清轉(zhuǎn)移至另一EP管中勿將酚層吸出8、9的步驟等體積氯仿乙戊醇混勻離心 8000g×5minEP管1/103molNaAcpH5.22.5倍體積的無水乙醇混勻置液氮10min或-20℃冰箱1h16 離心 10000g×10min17 棄上清留沉淀70%乙醇洗一次18 離心 10000g×10min棄上清留沉淀晾干加TEpH8.050μl 溶解沉淀加RNaseA(10mg/ml)3 5μl混勻稍離心3730min-20℃保存待用。小量酶切質(zhì)粒20μl反響體系。【操作方法】EP7μl三蒸水102μl5μlDNA10μl稍離心混勻6 37℃水浴1 1.5h無水乙醇沉淀 2.5倍體積無水乙醇混勻液氮10min或-20℃30min 離心棄上清晾干加10μlTE 建立其次個酶切體系37℃1 1.5h電泳鑒定【試劑及配制】1 0.5×TBE5×TBE貯存液然后用三蒸水稀釋10倍5×TBE配制 1000mlTris堿54g硼酸27.5g0.5molEDTApH8.02mlEB 10mg/ml瓊脂糖上樣緩沖液0.25%溴酚藍(lán)0.25%FF30%甘油【操作方法】用膠帶紙封住洗凈、晾干的電泳膠盒兩端放好梳齒水平放置于工作臺上0.5×TBE+瓊脂糖 1% 電爐上溶化勿暴沸待其冷卻至50 60℃時加入EB約5μl 充分混勻3 將凝膠倒入膠模35mm 避開產(chǎn)生氣泡4 在室溫中放置3045min撕去膠帶紙放入電泳槽電泳槽內(nèi)為0.5×TBE應(yīng)沒過凝膠去除梳齒預(yù)電泳10minDNA樣品與上樣緩沖液混合加進(jìn)上樣孔內(nèi)應(yīng)設(shè)一marker作比照60 100VDNA向陽極移動黑線為負(fù)極紅線為正極電泳完成后戴塑料手套取出膠盒將凝膠放紫外燈下觀看有無切出的電泳帶。大量培育轉(zhuǎn)化的細(xì)菌小量酶切鑒定證明細(xì)菌內(nèi)含有目的基因即可大量培育。10h

【操作方法】在500ml滅菌處理過的培育瓶中加LB培育基200ml 參加50mg/ml的氨芐貯存液200μl 將小量培育的菌液取2ml參加瓶中 37℃200 300r/min 振搖培育6可過夜。大量提取質(zhì)粒常用堿裂解法?！驹噭┘芭渲啤咳芤孩袢芤孩蛉芤孩螽惐?.3molNaAcpH5.26.平衡酚pH8.0氯仿乙戊醇 24 1無水乙醇9.70%乙醇TEpH8.0RNaseA(10mg/ml)12.溶菌酶100mg2ml三蒸水溶解分裝成200μl/管貯存于-20℃?zhèn)溆谩静僮鞣椒ā? 擴(kuò)增好的菌液裝入50ml離心管中置冰浴10min2 4℃離心 5000×10min3 50ml離心管中再離心棄上清將離心管倒置濾紙上1min 控干殘液參加6ml冰預(yù)冷的溶液Ⅰ 200μl溶菌酶充分振搖混勻加溶液Ⅱ10ml 緩慢振搖以充分混勻內(nèi)容物室溫放置10min參加8ml冰預(yù)冷的溶液Ⅲ 留神搖動離心管以混勻內(nèi)容物置冰酒精浴10min20min

7 4℃離心 10000g×10min留神倒出上清棄沉淀如有沉淀再次離心參加0.6體積異丙醇充分混勻-20℃放置20min10 4℃離心 10000g×10min棄上清晾干 2mlTEpH8.0溶解沉淀2ml5molLiCl溶液并混勻13 4℃離心 10000g×10min14 將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管 參加0.6體積異丙醇充分混勻-20℃放置15 4℃離心 10000g×10min棄上清70%乙醇洗一次4℃離心 10000g×10min 棄上清晾干1.2mlTEpH8.0中加RNaseA30μl 封管口 37℃水浴30min2EP管各加等體積平衡酚混合室溫離心5000g×5minEP管留神勿吸出酚相重復(fù)平衡酚抽提等體積氯仿異戊醇 24 1 抽提室溫離心5000g×5min回收上層水相勿吸出氯仿加1/10體積3molNaAC(pH5.2) 再加2.5體積無水乙醇充分混勻置-20℃30min10min室溫離心 12000g×15min棄上清70%乙醇洗一次再離心晾干溶于500μlTEpH8.0 -20℃保存取2μl稀釋至200μl 用紫外分光光度計測260nm、280nmOD值OD260/OD280=1.7 2.0 如小于1.7 蛋白未提凈大于2.0 有機(jī)溶劑多。DNA含量為OD260×50 μg/ml 。大量酶切質(zhì)粒【操作方法】1 EP管中依次參加70μl10×緩沖液10μl限制酶5μl質(zhì)粒DNA 2μg/μl 15μl稍離心以混勻2 37℃水浴1.5 2h5μl電泳鑒定酶解效果如不完全可延長時間或加限制酶雙酶解反響如兩種酶可用同一緩沖液則可同時參加一個體系稍增加反應(yīng)體積否則以乙醇沉淀晾干重建其次個反響體系。DNA片段電泳的方法如前述不同點在于①使用低熔點瓊脂糖在4℃冰箱中電泳②將2 3個梳齒用透亮膠布粘在一起以增加上樣量。DNA【操作方法】1 DNAEP2倍體積的TE緩沖液在70℃保溫10min 使凝膠條溶化2 冷卻至室溫加等體積平衡酚充分混勻后以6000g離心10min 回收水相留意不要將界面處的白色物質(zhì)即粉狀的瓊脂糖吸出再用等體積的氯仿/乙戊醇抽提一次3 將上清液轉(zhuǎn)移到一個的離心管中參加0.210mol2倍體積的無水乙醇置-20℃冰箱20min 離心沉淀核酸晾干后以TE溶解取2μl稀釋至200μlDNA濃度。標(biāo)記探針BoehringerMannheim地高辛標(biāo)記探針試劑盒?！静僮鞣椒ā?μlDNA加滅菌三蒸水至最終體積為16μl10min沸水浴馬上冰乙醇冷軋參加4μl探針標(biāo)記液試劑盒中vial1 略微離心混勻4 3720h5 2μl0.2molEDTApH8.065℃10min以終止反響。石蠟切片的處理【試劑及配制】1 二甲苯2 乙醇 100% 95% 90% 75%3 甲醇40.2molHCl50.1%TritonX-10060.2%PBS75mmolMgCl2-PBS8配制PBS10×的貯存液10倍NaCl80g137mmolKCl2g2.7mmolNa2HPO4·7H2O11.5g4.3mmolKH2PO42g1.4mmol配成1000ml pH7.3 高壓滅菌。9 蛋白酶K0.1molTris-ClpH8.0加50mmolEDTApH8.01μg/ml。10 4%多聚甲醛在通風(fēng)櫥中配制稱40g500mlDEPC水的燒瓶中加熱65℃并磁力攪拌使成乳白色懸液用1molNaOH調(diào)整pH7.0 呈清亮狀再參加約450ml的2×PBS 充分混勻再檢查pH 過濾后定容至1000ml 4℃保存?！静僮鞣椒ā繉⒖竞玫那衅攵妆舰?0min 二甲苯Ⅱ、Ⅲ各10min逐級酒精入水100%、95%、90%、75% 各5min 甲醇沖洗5min×2PBS2次0.2molHCl室溫作用10min 0.1%TritonX-100作用15min0.2%甘氨酸-PBS15min蛋白酶K37℃消化15 30min0.2%甘氨酸-PBS15minPBS-5mmolMgCl2210min4%15minPBS-5mmolMgCl2210min逐級酒精脫水37℃烤干保存。預(yù)雜交、雜交【試劑及配制】2×SSC20×SSC貯存液用時稀釋。NaCl175g3mol枸椽酸三鈉·2H2O88g0.3mol三蒸水加至1000ml 用1molHCl調(diào)pH7.04×SSC/50%去離子甲酰胺V/V去離子甲酰胺的配制500ml甲酰胺與25gBio-RadAG501-X8(20 50目)混合室溫避光攪拌4h 過濾分裝為50ml -20℃存放100×Denhardt液10g聚乙烯吡咯烷酮10g牛血清白蛋白10g100ml預(yù)雜交液去離子甲酰胺5ml20×SSC2.5ml加溫至50℃ 參加硫酸葡聚糖1g聚合物溶解后參加100×Denhardt500μl10%SDS500μl10mg/mlDNA100μl消毒三蒸水400μl充分混合雜交液將標(biāo)記好的探針用沸水浴10min 馬上冰酒精冷軋用預(yù)雜交液將探針稀釋至0.55ng/μl。【操作方法】2×SSC15min4×SSC/50%3715min每片加預(yù)雜交液50μl 放入濕盒42℃孵育2h去除預(yù)雜交液每片加雜交液50μl 放濕盒中42℃雜交12 18h 不能超過24h。雜交后處理【試劑及配制】12×SSC22×SSC/50%去離子甲酰胺31×SSC/50%去離子甲酰胺4PBS54×SSC/10mmolDTT先配制1molDTT 通風(fēng)櫥中稱3.1gDTT 溶于20ml消毒三蒸水中用時取2ml參加198ml4×SSC【操作方法】