黃酮類(lèi)藥物與牛血清白蛋白相互作用研究

黃酮類(lèi)藥物與牛血清白蛋白相互作用研究

血清是人和動(dòng)物血清中最豐富的蛋白質(zhì)，與各種帶正、負(fù)電負(fù)荷物質(zhì)和電中性材料相互作用。各種藥物進(jìn)入人體首先與血清白蛋白結(jié)合,通過(guò)血漿的存貯和運(yùn)輸,到達(dá)受體部位產(chǎn)生藥理作用。測(cè)定血清白蛋白的變化,可為疾病診斷、療效觀察提供有價(jià)值的資料及數(shù)據(jù)。因此,從不同角度研究以白蛋白為代表的蛋白質(zhì)與具有生物活性小分子間的相互作用目前已成為藥物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。熒光光譜法是研究生物大分子,特別是蛋白質(zhì)與各種有機(jī)小分子、離子或無(wú)機(jī)化合物相互作用的重要手段。通過(guò)熒光光譜技術(shù)可以獲得蛋白質(zhì)分子中熒光生色基團(tuán)的種類(lèi)、結(jié)構(gòu)和所處微環(huán)境及其分布情況等有用信息,同時(shí)還可以得到外源物質(zhì)與生物大分子相互作用的有關(guān)數(shù)據(jù)。黃酮類(lèi)化合物是指以黃酮(2-苯基色原酮)為母核而衍生的一類(lèi)黃色色素。其中包括黃酮的同分異構(gòu)體及其氫化的還原產(chǎn)物,也即以C6-C3-C6為基本碳架的一系列化合物。黃酮類(lèi)化合物大多數(shù)具有藥理活性,木犀草素、芹菜素和葛根素均屬于黃酮類(lèi)藥物,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。本工作通過(guò)熒光光譜方法研究了木犀草素、芹菜素和葛根素3種黃酮類(lèi)藥物與牛血清白蛋白(BSA)間的相互作用,探討了其與BSA作用的機(jī)理、熒光猝滅常數(shù)以及與BSA作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)等信息。1試驗(yàn)部分1.1配制0.0.0.0.0.5%10-1的緩沖溶液,在溶液中混溶。請(qǐng)如下做法RF-5301型熒光分光光度計(jì);TB-85型恒溫水浴;pHSJ-4A型pH計(jì)。牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:稱(chēng)取牛血清白蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量為65000)0.6500g,加5g·L-1氯化鈉溶液溶解,定容至100mL容量瓶,濃度為1.0×10-4mol·L-1。三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液:用0.20mol·L-1Tris和0.10mol·L-1鹽酸在試驗(yàn)溫度下用0.50mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.40。木犀草素、芹菜素、葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液:用TrisHCl緩沖溶液為溶劑配成1.0×10-3mol·L-1,在0~4℃冰箱中保存。所用試劑均為分析純,水為雙重蒸餾水。1.2熒光光譜測(cè)定在10mL比色管中依次加入pH7.40的TrisHCl緩沖溶液2mL,1×10-4mol·L-1BSA溶液1mL,以及一定量木犀草素、芹菜素、葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液,用水稀釋至刻度混勻,在試驗(yàn)溫度下恒溫1h,采用1cm石英比色皿,選擇激發(fā)波長(zhǎng)為285nm繪制熒光光譜,以及Δλ為60nm或15nm同步熒光光譜,木犀草素與葛根素?zé)晒鉁y(cè)定中激發(fā)和發(fā)射通帶均為5nm,測(cè)定芹菜素激發(fā)和發(fā)射通帶為3nm。2結(jié)果與討論2.1譜圖的建立按試驗(yàn)方法分別測(cè)定了木犀草素、芹菜素和葛根素濃度對(duì)牛血清白蛋白熒光光譜的影響,熒光光譜圖見(jiàn)圖2。由圖2可知:隨著木犀草素、芹菜素、葛根素濃度逐漸增大,牛血清白蛋白的熒光強(qiáng)度均逐漸降低,這是由于蛋白質(zhì)中存在的色氨酸和酪氨酸,使其具有內(nèi)源熒光,加入的外源性藥物木犀草素、芹菜素及葛根素與BSA之間產(chǎn)生相互作用導(dǎo)致BSA內(nèi)源熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低。2.2熒光加強(qiáng)研究的靜態(tài)猝滅類(lèi)型引起B(yǎng)SA熒光猝滅的原因可能有動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種。動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程遵循Stern-Volmer方程。式中:F0和F分別為不存在和存在猝滅劑時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度;[Q]為猝滅劑的濃度(mol·L-1);KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)(即Stern-Volmer猝滅常數(shù),L·mol-1);Kq是由擴(kuò)散過(guò)程控制的雙分子動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)(L·mol-1·s-1);τ0為沒(méi)有猝滅劑存在下熒光分子平均壽命,生物大分子熒光平均壽命約為10-8s。靜態(tài)猝滅過(guò)程遵循下式關(guān)系:式中:Ks為靜態(tài)猝滅常數(shù)(即配合物的締合常數(shù))。隨溫度的升高動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)增大,而靜態(tài)猝滅常數(shù)減小,可由此判斷熒光猝滅類(lèi)型。在不同的溫度下,以F0/F對(duì)相應(yīng)的[Q]作圖,可得到木犀草素、芹菜素、葛根素對(duì)BSA熒光猝滅的Stern-Volmer方程及猝滅常數(shù),見(jiàn)表1。一般認(rèn)為,各類(lèi)猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)為2×1010L·mol-1·s-1,而從表1結(jié)果可知:木犀草素、芹菜素和葛根素對(duì)BSA熒光猝滅的猝滅速率常數(shù)Kq數(shù)量級(jí)均在1012以上,可以初步判斷加入木犀草素、芹菜素及葛根素導(dǎo)致BSA熒光猝滅過(guò)程是以靜態(tài)猝滅為主,又隨溫度升高Stern-Volmer方程的斜率減小,進(jìn)一步表明該過(guò)程是以靜態(tài)猝滅為主。2.3f0-f/f對(duì)lg[q]的雙對(duì)數(shù)圖當(dāng)小分子與大分子結(jié)合時(shí)其表觀結(jié)合常數(shù)Kb與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n由下式求出:分別在292K,311K溫度下做木犀草素、芹菜素和葛根素與BSA的lg(F0-F)/F對(duì)lg[Q]的雙對(duì)數(shù)圖,根據(jù)截距和斜率求得不同溫度的Kb和n,見(jiàn)表2。由表3可看出:木犀草素與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n接近2,說(shuō)明木犀草素與BSA可形成兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。而芹菜素和葛根素與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n接近1,表明芹菜素和葛根素與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n接近1。木犀草素、芹菜素和葛根素與BSA的結(jié)合常數(shù)均大于104數(shù)量級(jí),表明木犀草素、芹菜素和葛根素與BSA之間有較強(qiáng)的結(jié)合作用,可以被蛋白質(zhì)運(yùn)輸和儲(chǔ)存。2.4溫度對(duì)牛血清白蛋白作用的影響藥物等有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)等生物大分子之間的結(jié)合力主要包括氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用力等。根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變?chǔ)Hm和熵變?chǔ)Sm的相對(duì)大小,可以判斷藥物與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類(lèi)型,在溫度變化不大時(shí),反應(yīng)的焓變?chǔ)Hm可以看作一個(gè)常數(shù),通過(guò)熱力學(xué)公式:式中:K類(lèi)似于在相應(yīng)溫度T下Stern-Volmer方程中的猝滅常數(shù)KSV;R為氣體常數(shù),計(jì)算出不同溫度下木犀草素、芹菜素和葛根素與牛血清白蛋白作用的自由能變?chǔ)Gm、焓變?chǔ)Hm和熵變?chǔ)Sm,見(jiàn)表3。木犀草素、芹菜素和葛根素與BSA的熱力學(xué)參數(shù)ΔrHm<0和ΔrSm>0,根據(jù)Ross等總結(jié)的判斷生物大分子與小分子結(jié)合力性質(zhì)和生物大分子自身結(jié)合力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律,推斷出木犀草素、芹菜素和葛根素與BSA之間的作用力是以靜電引力為主的。2.5forer偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移的曲線根據(jù)F?rster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論,當(dāng)供能體發(fā)射熒光,其熒光發(fā)射光譜與受能體的吸收光譜有足夠程度的重疊,且供能體與受能體之間的最大距離不超過(guò)7nm時(shí),將會(huì)發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致熒光猝滅,由此可求出小分子化合物和蛋白質(zhì)分子的結(jié)合位置相對(duì)于發(fā)射熒光的基團(tuán)之間的距離。據(jù)此理論,非輻射能量轉(zhuǎn)移效率E,供能體與受能體之間的結(jié)合距離R及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0之間有下列關(guān)系:式中:F和F0分別為存在和不存在受能體時(shí)供能體的熒光發(fā)射強(qiáng)度;K2為偶極空間取向因子;N為介質(zhì)折射常數(shù);Υ為BSA的熒光量子產(chǎn)率,試驗(yàn)條件下,K2取受能體和供能體各項(xiàng)隨機(jī)分布的平均值2/3,Υ取蛋白質(zhì)中色氨酸的量子產(chǎn)率0.15;N取水和有機(jī)物折射指數(shù)的平均值1.334;J為給體熒光發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊積分,可表示為:式中:F(λ)是BSA在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度;ε(λ)是受能體在波長(zhǎng)λ處的摩爾吸光率。采用矩形分割法可以求出光譜重疊區(qū)域的積分值J,繼而求出R06,E和r的數(shù)值。根據(jù)木犀草素、芹菜素和葛根素在292K時(shí)與BSA的物質(zhì)的量之比為1比1時(shí)的吸收光譜與熒光光譜的重疊圖(圖略),以F?rster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移機(jī)理,積分圖中光譜重疊部分,求得重疊積分值J,進(jìn)而根據(jù)上式求出R0,E和r的值見(jiàn)表4。由表4可知:木犀草素、芹菜素和葛根素與BSA分子間的距離r<7nm符合能量轉(zhuǎn)移理論,說(shuō)明木犀草素、芹菜素和葛根素與BSA是足夠靠近,其結(jié)合是通過(guò)非輻射能量轉(zhuǎn)移而促使蛋白質(zhì)的熒光猝滅。2.5-l-110.110.1的熒光光譜由Δλ=15nm所作同步熒光光譜只顯示酪氨酸殘基的光譜特征,而Δλ=60nm的同步熒光光譜僅顯示色氨酸殘基的光譜特征。因芳香氨基酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)與其所處環(huán)境極性有關(guān),若最大發(fā)射波長(zhǎng)改變,說(shuō)明殘基所處的微環(huán)境發(fā)生了改變,由發(fā)射波長(zhǎng)的改變可判斷BSA中芳香氨基酸殘基所處微環(huán)境的變化。在BSA濃度為0.1×10-5mol·L-1時(shí),逐漸增加木犀草素、芹菜素和葛根素濃度,并逐步測(cè)定Δλ為15nm和Δλ為60nm時(shí)的同步熒光光譜圖。隨著木犀草素、芹菜素和葛根素的加入,酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光光譜峰均產(chǎn)生猝滅,其中木犀草素的加入導(dǎo)致酪氨酸殘基的熒光光譜峰位發(fā)生了紫移,色氨酸熒光光譜峰位置無(wú)明顯變化,表明木犀草素的加入使得酪氨酸殘基所處的微環(huán)境疏水性增加,親水性降低,而對(duì)色氨酸殘基微環(huán)境構(gòu)象的改變不大;芹菜素的加入對(duì)酪氨酸及色氨酸熒光光譜的位置均無(wú)明顯移動(dòng),表明芹菜素對(duì)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的改變不大;葛根素的加入對(duì)酪氨酸殘基的熒光峰的位置