鐵皮石斛離體培養(yǎng)及植株再生體系的建立

鐵皮石斛離體培養(yǎng)及植株再生體系的建立

0發(fā)酵鐵皮石斛的繁殖與繁殖剝皮屬植物，也被稱(chēng)為黑節(jié)草，俗稱(chēng)楓豆科。分布于云南、安徽、貴州、浙江、江西、廣東和廣東。它不僅是珍貴的室盆花，也是珍貴的中藥。鐵皮石斛的有性繁殖極為困難,其種子極為細(xì)小,胚胎發(fā)育不完全,無(wú)胚乳組織,在自然狀態(tài)下發(fā)芽率極低,苛刻的生長(zhǎng)環(huán)境,也限制了其有性繁殖。何平榮等研究表明,鐵皮石斛平均自然結(jié)實(shí)率為0.31%。鐵皮石斛主要靠根部無(wú)性分蘗繁殖而不斷生出新的植株并成叢生長(zhǎng),有時(shí)也從上部莖節(jié)處生根長(zhǎng)出新植株。而常規(guī)條件下人工繁殖又較難,不能滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求,隨著人們對(duì)它的深入研究與廣泛利用,需要大量的石斛作為原料投入藥品的研制與生產(chǎn),因此,研究培養(yǎng)石斛和開(kāi)發(fā)鐵皮石斛具有重要的意義,長(zhǎng)期以來(lái)組織培養(yǎng)在植物生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用,是產(chǎn)生極大經(jīng)濟(jì)效益的一項(xiàng)生物技術(shù)。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料云南鐵皮石斛,取其莖段、葉片作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。1.2測(cè)試方法1.2.1反復(fù)沖洗法取鐵皮石斛莖,去除多余葉片后用解剖刀將莖切成含3～4個(gè)節(jié)點(diǎn)的莖段,保留節(jié)點(diǎn)。清水沖洗3min,用70%的乙醇浸泡10～60s,再轉(zhuǎn)入0.1%的氯化汞中,滅菌5～11min后倒去氯化汞溶液,用無(wú)菌水反復(fù)漂洗材料3遍以上。用無(wú)菌紙吸去莖段上多余水分,將其切成1～2cm帶一個(gè)芽點(diǎn)的莖段,接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。1.2.2分離的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法鐵皮石斛培養(yǎng)基均添加3%蔗糖,0.7%瓊脂,pH值為5.8。按不同目的在基本培養(yǎng)基中加入6-BA、NAA、IBA,每個(gè)培養(yǎng)瓶分裝50m培養(yǎng)基,密封。經(jīng)過(guò)121℃高溫滅菌25min。不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在基本培養(yǎng)基MS中加入細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素,采用不用濃度水平的NAA和6-BA。組培苗的壯苗與生根,將生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定的試管苗接種于添加不同激素組合的1/2MS培養(yǎng)基上。1.2.3培訓(xùn)條件接種鐵皮石斛培養(yǎng)材料的組培苗在組織培養(yǎng)室中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為(26±2)℃,光照14h/d,光強(qiáng)1500～2000lx。1.2.4種子培養(yǎng)cm取誘導(dǎo)形成的不定芽,要求芽高2～3cm,帶3～5片葉的不定芽,將其接種到不同處理的生根培養(yǎng)基上,進(jìn)行培養(yǎng)。觀察并統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)情況,計(jì)算生根率。1.2.5培養(yǎng)瓶安裝當(dāng)生根苗培養(yǎng)莖長(zhǎng)至3～5cm,根長(zhǎng)1～2cm時(shí)開(kāi)始移栽,移栽前將培養(yǎng)瓶開(kāi)蓋放置在組培室中煉苗3～5d。組培苗出瓶時(shí),打開(kāi)瓶塞將培養(yǎng)基與小苗一起輕輕取出,用流水洗凈培養(yǎng)基,將幼苗的根舒展后栽入盛有基質(zhì)的穴盤(pán)中。2結(jié)果與分析2.1min消毒時(shí)間處理試驗(yàn)結(jié)果表明(見(jiàn)表1),11min的處理時(shí)間污染率為最低,但死亡率最高為46.7%;9min消毒時(shí)間處理效果最佳,污染率較低的同時(shí)成活率最高。所以,經(jīng)使用70%乙醇進(jìn)行表面滅菌處理30s后,再用0.1%氯化汞溶液消毒9min是最適宜鐵皮石斛莖段的消毒方法。2.2培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況將消毒處理的莖段接種在以MS為基本培養(yǎng)基,不同激素組合的培養(yǎng)基中(表2),莖段繼續(xù)生長(zhǎng),接種5～30d后莖段節(jié)點(diǎn)處開(kāi)始長(zhǎng)出不定芽(圖1)。45d后觀察統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)生長(zhǎng)情況。從表2可以看出,當(dāng)在MS基本培養(yǎng)基上添加6-BA和NAA不同激素水平均可以誘導(dǎo)不定芽,但增殖倍數(shù)和誘導(dǎo)時(shí)間有所差異。1號(hào)培養(yǎng)基為沒(méi)有添加任何激素的MS基本培養(yǎng)基,接種的外植體生長(zhǎng)緩慢,沒(méi)有誘導(dǎo)出不定芽且植株無(wú)明顯變化。5、6、7、8和10號(hào)培養(yǎng)基增殖倍數(shù)均低于2倍,2、3和9號(hào)培養(yǎng)基增殖倍數(shù)均高于2倍,且2號(hào)最高為3.1倍。1、4、8和10號(hào)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)時(shí)間均超過(guò)了30d,2號(hào)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)時(shí)間最短為5～7d有不定芽點(diǎn)出現(xiàn),且數(shù)目多。從生長(zhǎng)情況上看,均生長(zhǎng)良好,出現(xiàn)白化及褐化情況極少,但少有葉片黃化的現(xiàn)象。NAA濃度在0.2～0.5mg/L時(shí)有根系發(fā)生,2和3號(hào)培養(yǎng)基中芽根部有少量根系生長(zhǎng)。綜合分析得到,2號(hào)培養(yǎng)基激素組合MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA對(duì)不定芽誘導(dǎo)率最高,增殖倍數(shù)最高,誘導(dǎo)時(shí)間最短,不定芽生長(zhǎng)良好,且根系生長(zhǎng)量少。2.3葉片誘導(dǎo)無(wú)愈傷組織的觀察選取鐵皮石斛無(wú)菌莖段、葉片進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo),接種在MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA培養(yǎng)基上,經(jīng)過(guò)30d后觀察記錄(表3)。由表3可知,以葉片為外植體進(jìn)行誘導(dǎo),無(wú)愈傷組織形成,且大部分死亡;在培養(yǎng)基上接種的無(wú)菌莖段在莖段基部切口處形成愈傷組織,愈傷組織經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培養(yǎng)后形成桑果狀的原球莖以及具有原球莖與不定芽的組織體(圖2)。2.4低濃度naa對(duì)組培苗生根的影響將鐵皮石斛的不定芽接種至不同處理的生根1/2MS培養(yǎng)基上,45d后觀察記錄幼苗的生根數(shù)及根長(zhǎng)(圖3、4),結(jié)果見(jiàn)表4。NAA和IBA兩種生長(zhǎng)素均能誘導(dǎo)并促進(jìn)鐵皮石斛組培苗生根。生根率%=(分化出不定根的莖段數(shù)/莖段總接種數(shù))×100%。由表4可知,IBA為低濃度0.5mg/L時(shí)有利于組培苗的生根,而當(dāng)濃度升高為2.0mg/L時(shí)則明顯抑制根的生長(zhǎng),生根率低僅為10%,且根的生長(zhǎng)狀況不良;當(dāng)存在低濃度的NAA為0.5mg/L時(shí),生根率最高為96.7%,且平均根長(zhǎng)最長(zhǎng)2.5cm,濃度升高至2.0mg/L時(shí)生根率有所下降僅為60%,根長(zhǎng)為0.9cm。綜上所述,1/2MS+0.5mg/LNAA的生根率最高,且根的生長(zhǎng)情況好,是最適宜的鐵皮石斛組培苗生根培養(yǎng)基,其次為1/2MS+0.5mg/LIBA的激素組合培養(yǎng)基。2.5幼苗處理與開(kāi)栽組培苗一般長(zhǎng)至3～4cm高,有3片以上葉和3～5條根時(shí),平均每條根達(dá)到1～2cm長(zhǎng),從培養(yǎng)瓶中輕輕取出幼苗,用流水輕輕將附著在根上的瓊脂沖洗干凈,以免瓊脂發(fā)霉引起爛根,然后將幼苗的根舒展開(kāi)栽入盛有基質(zhì)的穴盤(pán)中。為了提高出瓶成活率,在出瓶前把瓶蓋全部打開(kāi),放置在組培室中煉苗3～5d。移栽到基質(zhì)中的前2周進(jìn)行遮光處理,葉面噴水保持濕潤(rùn)勿施肥,可以噴灑抗菌劑防止根部腐爛(圖5)。3復(fù)雜組培體的誘導(dǎo)和增殖有效地控制污染是植物離體培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。培養(yǎng)基和無(wú)菌操作方面的污染目前已經(jīng)得到控制。外植體造成的污染最復(fù)雜,也最難控制,其原因可能是由于細(xì)引起的,也可能是真菌引起的。微生物可能是腐生的,也可能是內(nèi)生的,最難處理的則是內(nèi)生菌。鐵皮石斛外植體含有較多的內(nèi)生真菌,從鐵皮石斛根中分離出內(nèi)生真菌約25種,因此鐵皮石斛的外植體消毒應(yīng)特別注意也較為困難。不定芽誘導(dǎo)和增殖的基本培養(yǎng)基以MS為宜,同時(shí),植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)鐵皮石斛的組織培養(yǎng)起重要作用,雖然用量小,但在植物組織培養(yǎng)中使用的激素包括生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素等,而NAA和6-BA組合常用于誘導(dǎo)不定芽和生根。結(jié)果與其他研究報(bào)道的鐵皮石斛不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方有所不同,可能與培養(yǎng)的石斛品種有關(guān)。同時(shí),適宜的接種密度和不