油菜線粒體dna提取純化方法的構(gòu)建及應(yīng)用

油菜線粒體dna提取純化方法的構(gòu)建及應(yīng)用

植物骨骼dna（mtd）復(fù)雜且易變，其研究相對緩慢。隨著基因克隆和dynamist分析技術(shù)的迅速發(fā)展和普及，以及對植物實質(zhì)異生殖器（cytopsison）與顆粒之間的密切關(guān)系的認識，植物mtda的研究是現(xiàn)代植物生物學(xué)研究的熱點之一。mtda的快速有效提取是骨瘦如柴的研究的基礎(chǔ)。然而，在植物中，由于細胞中的細胞有較大的液泡和綠葉細胞的干擾，分離mtda的難度顯著增加。這是一種傳統(tǒng)的高純度提取方法，用于提取高純度和高純度的mtda，并且主要用于農(nóng)業(yè)研究。這些方法的操作相對復(fù)雜，因此很難獲得具有高純度的優(yōu)質(zhì)mtda，這需要時間和成本。之后，對于不同的植物，我們提出了幾種不同的方法，以改善它們的業(yè)務(wù)。它的基本原則是將差速離心和密度離心分離到身體的中心分離，以去除其他污染物，用sds分離和釋放mtd，然后用有機溶劑提取相對完整的mtd。然而，在提取不同植物骨骼的d時，不同的影響因素是極其復(fù)雜的。這些方法存在產(chǎn)量低、純度低、無法滿足后續(xù)研究等缺點。作為油藏的材料，在前人研究的基礎(chǔ)上，對不同的影響因素和處理方法進行了分析和比較，并提出了一種快速有效的植物骨骼dna提取方法體系。1材料和方法1.1幼苗的培養(yǎng)實驗材料為油菜幼苗,油菜種子由中國科學(xué)院油料作物研究所提供.播種在溫室中,自然光下培養(yǎng)長到適當(dāng)大小的幼苗,實驗前2~3d將幼苗套上黑色塑料袋暗培養(yǎng)(黃化),以減少葉片所含糖類物質(zhì).1.2試劑Dnase-1、RNA酶、蛋白酶K均為Takara產(chǎn)品.其余試劑購自國化集團和上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,均為分析純.edta-na620.3甘露糖醇400mmol;Tris-HCl(pH7.8)50mmol;EDTA-Na220mmol;NaCl1.0mol;牛血清白蛋白0.20%;半胱氨酸0.10%;PVP(聚乙烯吡咯烷酮)1%(注意:BSA、半胱氨酸和PVP在實驗前加).mte葡萄糖緩沖緩沖區(qū)甘露醇400mmol;Tris-HCl(pH7.8)50mmol;EDTA-Na220mmol.處理緩沖液mt甘露醇400mmol;Tris-HCl(pH7.8)50mmol;BSA0.1%(實驗前加).edta-na2004.3NaCl1.0mol;Tris-HCl(pH8.0)50mmol;EDTA-Na250mmol;氰代磷酸二乙酯(DEPC)2.0%;NaF50mmol.50tae儲存溶液組成Tris-醋酸2mol,EDTA100mmol.1.3方法1.3.13級線的提取與純度1.3.1.研缽加研磨法semoregact為了保持組織破碎時線粒體的完整性,本實驗設(shè)立3種不同的緩沖液配比,探索最佳的勻漿緩沖液.(1)取一定量經(jīng)4℃預(yù)冷的油菜黃化苗,在冰水中沖洗10min,濾紙上晾干水分,去除葉脈后剪碎.(2)稱取20g于預(yù)冷的研缽中,取80mLGB(buffer/材料為3~5mL/g)分2次研磨.研磨前先將剪碎組織放在緩沖液里浸泡一段時間,使細胞材料提前充分進入安全狀態(tài),減少細胞器的損壞.(3)6層無菌紗布(45μm孔徑)過濾,合并濾液.將濾液等量分裝在2根無菌的50mL離心管中.1.3.1.分離法提取控制mtcda的最佳步驟采取差速離心與密度梯度離心相結(jié)合.第一步,設(shè)立一組差速離心力組合對比實驗,將線粒體從破碎組織中粗分離,在顯微鏡下檢測分離效果,確定最佳離心力;第二步,參照線粒體在蔗糖中的浮力密度,配制兩種不同密度的蔗糖溶液(23%∶40%)作離心介質(zhì),將粗線粒體鋪于離心管頂部,通過離心讓線粒體分布于介質(zhì)界面,使其得到很好的純化.為防止葉綠體和核基因組的污染,在線粒體裂解前,進行Dnase-1處理,在這個過程中,破裂的線粒體所釋放出來的mtDNA也被降解,因此應(yīng)盡量保證線粒體的完好性.具體步驟如下.(4)勻漿濾液2000g(3800r·min-1)離心10min,去除破碎組織.(5)取上清,4000g(5500r·min-1)離心20min,去除未破碎的細胞、纖維與原生質(zhì)體等.(6)取上清,20000g(13000r·min-1)離心20min,得沉淀.(7)用潔凈的毛筆將沉淀重懸在30mLGB中,13000r·min-1離心20min,得線粒體沉淀.(8)將沉淀懸浮在MTE緩沖液中,小心鋪在按23%∶40%配好的蔗糖密度梯度液上,12000r·min-1離心45min.然后用3mL滅菌注射器收集梯度液界面的線粒體層.(9)將每管收集的純線粒體沉淀用毛筆重懸在1mLMT中,加20μL1mol的MgCl2,1μL250mg/mL的Dnase-1溶液.37℃水浴反應(yīng)1h.(10)加0.5mol的EDTA40μL,混勻10min終止DNase-1酶消化反應(yīng).(11)加3倍體積WB混勻,13000r·min-1離心20min,得到較純的線粒體沉淀.(12)用緩沖液WB洗脫掉殘留的DNase(以上所有操作除特別說明外均在4℃以下或者冰浴中進行).1.3.2提取純度mtda1.3.2.mtnda的合成預(yù)實驗用CTAB裂解,用有機溶劑抽提效果不佳,故改進選用SDS裂解法,用高鹽沉淀雜質(zhì),裂解完后用有機溶劑反復(fù)抽提,然后用無水乙醇沉淀mtDNA.為增強裂解效果,添加適當(dāng)?shù)牡鞍酌窴.(13)將線粒體沉淀懸浮在600μLTE(10mmolTris-HClpH8.0;1mmolEDTA-Na2)中,緩慢加入30μL20%SDS,再加蛋白酶K(10mg/mL)1μL,振蕩混勻,37℃水浴反應(yīng)1h.(14)室溫下待溶液清亮后,加5mol的KAc100μL,混勻冰浴30min.(15)室溫3000r·min-1離心15min,小心吸取上清.依次加等體積的苯酚,1∶1的苯酚∶氯仿,氯仿抽提,12000r·min-1離心5min,吸取上清.(16)加1/10體積的5mol的NH4Ac溶液,再加2倍體積的的預(yù)冷無水乙醇.-20℃靜置2~3h或過夜.12000r·min-1離心20min,得mtDNA沉淀.(17)用適量70%乙醇洗滌沉淀2次,再用無水乙醇洗滌1次,倒置在濾紙上讓其干燥.(18)將干燥后的mtDNA沉淀溶解于600μLTE中,加10μL20%SDS,5μL蛋白酶K(10mg/mL)和3μLRNase(10mg/mL).37℃水浴反應(yīng)1h.1.3.2.苯酚氯化法(19)反應(yīng)結(jié)束后,加100μL5mol的NaCl,80μLCTAB/NaCl溶液(10%CTAB,0.7molNaCl),65℃水浴反應(yīng)30min,其間顛倒混勻1次.(20)加等體積的1∶1的苯酚∶氯仿溶液,12000r·min-1離心5min,小心吸取上清.(21)加等體積的氯仿,12000r·min-1離心5min,小心吸取上清.(22)70%乙醇洗滌沉淀2次,去除殘留的鹽分和CTAB.倒置EP管,室溫干燥,溶于30μLTE中,于-20℃保存?zhèn)溆?1.3.3mtda的定量和定性分析(1)采用傳統(tǒng)方法，用紫外分光光度計測定mtda在obd260之間的情況nm和OD280nm及OD230nm的值,計算mtDNA溶液的濃度和純度.(2)取2μL所得的DNA溶液,用1%瓊脂糖電泳以觀察DNA的帶型及分子量大小.(3)取1μL線粒體DNA溶液,加入4U限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ于37℃下酶切4h,用1%瓊脂糖電泳以觀察酶切效果.2結(jié)果與分析2.1勻漿緩沖液的選擇勻漿緩沖液的組成和各成份的濃度對保持線粒體的完整性非常關(guān)鍵,通過對提取的線粒體懸浮液顯微鏡下檢測觀察,發(fā)現(xiàn)3種不同緩沖液中A液作為勻漿緩沖液最佳(見表1).實驗中用NaCl適當(dāng)提高了緩沖液的離子濃度,使用半胱氨酸替代傳統(tǒng)的β-巰基乙醇,在防止氧化產(chǎn)物對線粒體的損壞方面效果更好,并且對線粒體的毒害作用更小.2.2復(fù)配體的離心設(shè)計利用差速離心分離得到線粒體操作簡單快捷,但分離的效果不好.因為組織勻漿液中線粒體、葉綠體、細胞核以及破碎組織等的顆粒直徑相差不是很大;密度梯度離心,需確定線粒體的浮力密度,傳統(tǒng)的方法是采用CsCl連續(xù)或不連續(xù)密度梯度進行長時間的高速離心分離線粒體,但操作復(fù)雜,所需時間長,成本高.本實驗結(jié)合差速離心和密度梯度離心的優(yōu)缺點,對原方法進行改進,簡化密度梯度離心程序,設(shè)計了5組不同的離心力組合,實驗結(jié)果見表2.通過鏡檢最終確定最佳組合為組合5:分離破碎組織的離心力4000g(5500r·min-1),分離線粒體的離心力20000g(13000r·min-1),分離得到的線粒體量多且純凈.2.3蛋白脫凈測定經(jīng)驗數(shù)據(jù)表明,純凈的核酸溶液A260/A230的消光值比大于或等于2.0;A260/A280大于或等于1.80.A260/A280值過小,說明蛋白未脫凈;A260/A230過小,說明有雜質(zhì)(一般為多酚類或色素).通過紫外分光光法對提取的mtDNA進行檢測得:A260/A230=2.28,A260/A280=1.88,所提mtDNA純度較高.mtDNA的質(zhì)量濃度平均為1.344(μg/μL).在實驗手段嚴格的條件下,mtDNA產(chǎn)率可達到每克材料4~5μg,產(chǎn)率較高.2.4mtda的定性分析2.4.1dna電泳檢測用黃化苗提取mtDNA時,核DNA和RNA對mtDNA純度有很大影響,在對線粒體進行裂解前若未用DNaseⅠ消化處理,所提取的mtDNA中有細胞核DNA雜質(zhì),電泳泳道會有明顯拖尾現(xiàn)象;所提取的mtDNA若未用RNase處理,電泳圖中會混雜有RNA.從圖1可知,用本方法所提取的mtDNA電泳帶型清晰,無拖尾且未發(fā)生降解現(xiàn)象,大小約為20kb.2.4.2mtcda的純度在DNA序列分析、基因組的功能圖譜繪制、DNA的無性繁殖、基因文庫的構(gòu)建等工作中,建立限制性內(nèi)切酶圖譜都是不可缺少的環(huán)節(jié).DNA的純度嚴重影響到限制性酶切及圖譜構(gòu)建,因此對線粒體DNA的純度要求很高.從圖1(a-b)可知,所提取的mtDNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶(EcoRI,SABC)酶解,電泳結(jié)果譜帶清晰、重復(fù)性好、酶切徹底.提取的mtDNA純度達到了限制性酶切要求及線粒體DNA的后續(xù)研究.3mtcda的純化本研究成功構(gòu)建了油菜黃化苗線粒體DNA的提取純化方法體系.克服了傳統(tǒng)方法的操作復(fù)雜、耗時長、成本高的弊端,也解決了后來簡化改進方法的效果不好的問題,產(chǎn)率較高,純度完全能滿足限制性酶切等后續(xù)研究的要求.本方案主要的改進手段有:(1)在研磨破碎組織前,將材料剪切較碎后,置于預(yù)冷的勻漿緩沖液中4℃放置15~30min,使組織提前充分進入安全的環(huán)境,防止線粒體的破壞.(2)對勻漿緩沖液的組分進行了對比研究,找到了最佳組分和配比濃度.(3)本研究結(jié)合差速離心和密度梯度離心,找到最佳差速離心力組合,簡化改進密度梯度離心,使線粒體的分離效果得到明顯提高.(4)在去除殘余的DNase時,使用DEPC代替NaF,很好地抑制了在EDTA環(huán)境下仍有活性的DNase.(