八核酸分子雜交

核酸雜交及其他技術(shù)第一節(jié)核酸分子探針的標(biāo)記一、探針的定義及類型

核酸分子探針是指用放射性核素或其他標(biāo)記物標(biāo)記的、能與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用的DNA或RNA片段。

根據(jù)來源和性質(zhì)不同1.基因組DNA探針優(yōu)點(diǎn)：可來源于克隆化的各種基因，容易獲得。缺點(diǎn)：需要避免使用真核生物基因組中存在內(nèi)含子及非編碼序列，否則可能因高度重復(fù)序列存在引起非特異性雜交而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。2.cDNA探針優(yōu)點(diǎn)：不存在內(nèi)含子及其它高度重復(fù)序列，特異性高。缺點(diǎn)：需要以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，不易獲得，還需注意poly（dT）可產(chǎn)生非特異性雜交。

3.RNA探針優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性高（RNA/RNA或RNA/DNA）、特異性強(qiáng)（雜交條件更為嚴(yán)格）、效率高（不存在互補(bǔ)雙鏈的競爭性結(jié)合）。不存在高度重復(fù)序列，非特異性雜交少。雜交后可用RNase將未雜交的探針分子消化掉，從而使本底降低。是一種較為理想的探針。缺點(diǎn)：RNA極易降解，不易操作；有poly（A）尾，有時(shí)會影響特異性，但可克服（在雜交液中加入PolyA封閉待測核酸序列中可能存在的PolyT或PolyU）。4.寡核苷酸探針優(yōu)點(diǎn)：可隨心所欲合成需要的探針（大多數(shù)為15-30bp)，可用于基因點(diǎn)突變分析（一個堿基不配對也會影響其溶解溫度），雜交所需時(shí)間短（序列的復(fù)雜性降低）。缺點(diǎn)：靈敏度較低（探針?biāo)鶐?biāo)記物較少）設(shè)計(jì)寡核苷酸探針的原則

（根據(jù)已知核酸序列）1、探針長度一般要求為10-50bp2、G+C含量應(yīng)為40-60%3、不應(yīng)有大于4bp的反向互補(bǔ)配對，避免形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)4、避免有同一堿基的連續(xù)出現(xiàn)5、在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行同源性比較（大于70%或連續(xù)有8個堿基相同時(shí)最好不用）二、探針的標(biāo)記物理想的標(biāo)記物：敏感度高；特異性強(qiáng)；不影響探針分子的主要理化特性；標(biāo)記、檢測方法簡單、探針保存時(shí)間長；對環(huán)境無污染、對人體無損害；價(jià)格低廉。（一）放射性標(biāo)記物（二）非放射性標(biāo)記物（一）

放射性標(biāo)記物

----放射性核素利用放射性核素能產(chǎn)生射線的特性將核素標(biāo)記在核酸合成所必需的NTP或dNTP上，通過一定方法摻入到DNA或RNA中去制成探針，與待測的核酸雜交后，核素產(chǎn)生的或射線可使底片感光的特性，通過放射自顯影的方法進(jìn)行檢測。產(chǎn)生射線的核素：32P、3H、35S產(chǎn)生射線的核素：125I1、常用的放射性核素

（1）32P：產(chǎn)生穿透力強(qiáng)的

射線，放射自顯影所需時(shí)間短，靈敏度高，是最常用的放射性標(biāo)記物，但半衰期短（14.3天），射線散射嚴(yán)重。多采用位和位標(biāo)記dNTP或NTP。（2）35S：射線散射作用弱，分辨率高、半衰期長（87.1天），但釋放的

射線穿透力弱，靈敏度低。O(S)O(S)O(S)OH-P-O-P-O-P-O-CH2O鹼基O

OOHH(OH)ɑβ?2、放射性標(biāo)記物的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高：0.01pg特異性強(qiáng)缺點(diǎn)：放射性污染成本高、半衰期短，不能長期保存（二）非放射性標(biāo)記物1、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：無放射性污染成本低、操作簡單穩(wěn)定性好，可長期存放缺點(diǎn)：敏感性、特異性均略低于放射性核素2、常用的標(biāo)記物

（1）生物素：1-2pg

生物素化核苷酸：bio-16-dUTPbio-11-dUTP生物素化核苷酸----通過酶促反應(yīng)摻入到DNA中去制成探針----雜交----抗生物素蛋白-生物素-酶的復(fù)合物----加底物----顯色

光敏生物素：生物素與光敏基團(tuán)結(jié)合----光敏生物素----光敏生物素與核酸探針混合----在強(qiáng)光的作用下----光敏基團(tuán)與核酸共價(jià)結(jié)合----生物素標(biāo)記的探針生物素化的核苷酸和光敏生物素生物素光敏基團(tuán)（2）地高辛甙元Dig-dUTP----通過酶促反應(yīng)摻入到DNA中去制成探針----雜交----加抗地高辛-酶的復(fù)合物----加底物----顯色靈敏度較高：0.1pg特異性較生物素高是較理想的非放射性標(biāo)記物三、探針的標(biāo)記方法體內(nèi)標(biāo)記法體外標(biāo)記法化學(xué)標(biāo)記法酶促標(biāo)記法（一）化學(xué)標(biāo)記法光敏生物素的標(biāo)記光敏基團(tuán)在光照下與核酸堿基起交聯(lián)反應(yīng)生物素為檢測時(shí)的標(biāo)記物生物素-補(bǔ)骨脂（Biotin-psoralen）

補(bǔ)骨脂素是一種光敏物質(zhì)，與生物素連接成為生物素-補(bǔ)骨脂素。補(bǔ)骨脂素在紫外線照射下與嘧啶堿基發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，加入到待標(biāo)記的DNA中，得到生物素標(biāo)記核酸探針?？蓸?biāo)記ssDNA/dsDNA/RNA/寡核苷酸靈敏度高

（二）酶促標(biāo)記法缺口翻譯法或切口平移法隨機(jī)引物法末端標(biāo)記法cDNA探針的標(biāo)記RNA探針的標(biāo)記（一）缺口翻譯法或切口平移

（nicktranslation）

限量DNA酶I(Mg2+)DNA聚合酶I+32P-dNTP變性32P部分標(biāo)記的單鏈DNA片段5‘3‘3‘5‘5’-3’外切酶和5’-3’聚合酶5’3’5’3’5’缺口翻譯法的原理限量DNaseI在待標(biāo)記的雙鏈DNA的每一條鏈上產(chǎn)生若干個單鏈缺口。利用E.coliDNA多聚酶I的5’-3’外切酶的活性和5‘-3’多聚酶的活性，在缺口處5’末端每切除一個核苷酸，則在3’末端添加一個核苷酸，以修補(bǔ)缺口。隨著缺口在DNA鏈上的移動，標(biāo)記的核苷酸就摻入到新合成的DNA鏈中。缺口翻譯法的特點(diǎn)快速、簡便、標(biāo)記的探針均一、特異性高僅適用于較長的雙鏈DNADNA多聚酶必須是E.ColiDNA多聚酶的全酶DNA酶I的濃度一定要適宜（二）隨機(jī)引物法

（randompriming)

隨機(jī)寡核苷酸引物（randomprimer）：含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物，可以與任意核苷酸序列雜交，起到聚合酶反應(yīng)引物的作用。E.coliDNA聚合酶I的Klenow大片段（僅具有5’-3’多聚酶的活性，而無5’-3’外切酶的活性）。5‘3‘3‘雙鏈DNA變性隨機(jī)引物Klenow大片段32P-dNTP3‘5‘變性隨機(jī)引物標(biāo)記法隨機(jī)引物法標(biāo)記的原理待標(biāo)記的雙鏈DNA經(jīng)變性后與隨機(jī)引物混合隨機(jī)引物按堿基互補(bǔ)的原則與模板DNA的相應(yīng)區(qū)域結(jié)合DNA多聚酶I的Klenow大片段即從引物3’-OH端開始合成互補(bǔ)DNA鏈反應(yīng)中若加入修飾的dNTP即可獲得標(biāo)記的DNA探針隨機(jī)引物法的特點(diǎn)不但可用于雙鏈DNA的標(biāo)記，而且可用于單鏈DNA和RNA的標(biāo)記操作方便標(biāo)記率高（三）末端標(biāo)記法末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶法（terminaldeoxynucleotidetransferase)

5’——DNA——3’OH+-32p-dNTP

5’_______DNA_________3’(pdN)n+nPPi(焦磷酸）

末端轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶法的特點(diǎn)標(biāo)記活性高不能控制增加核苷酸的數(shù)量（三）末端標(biāo)記法T4多核苷酸激酶法（methodofT4polynucleotidekinase)3’——————5’OH+32P-P-P-A（ATP）3’————————5’32P+PPAT4多核苷酸激酶T4多核苷酸激酶法的特點(diǎn)可用于單鏈或雙鏈DNA和RNA樣品的5’末端標(biāo)記。此法極少用于制備核酸分子雜交探針，主要用于核酸序列測定時(shí)的末端標(biāo)記。（四）cDNA探針的標(biāo)記5’AAAAAA3’5’AAAAAA3’TTTTTT5’AAAAAA3’TTTTTTOligo（dT）反轉(zhuǎn)錄酶dNTP（其中一種為32P-dNTP）堿變性SephadexG50柱層析TTTTTT第二節(jié)核酸分子雜交技術(shù)一、基本原理具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下（適當(dāng)?shù)臏囟?、離子強(qiáng)度等），按堿基互補(bǔ)的原則，重新形成雙鏈DNA的過程。二、雜交的基本過程

變性

預(yù)雜交

雜交洗膜

雜交信號的檢測１、變性（Denaturation）熱變性：95-100°C,5-10分鐘堿變性：0.5Mol/LNaOH,30分鐘2、預(yù)雜交

目的是用非特異性DNA分子（鮭精DNA或小牛胸腺DNA）及其他高分子化合物（Denharht’s溶液）、脫脂奶粉等將待測核酸分子中的非特異性位點(diǎn)封閉，防止出現(xiàn)非特異性雜交。２、雜交（hybridization)

變性的單鏈DNA按堿基配對的原則，在適當(dāng)?shù)臈l件下重新締合形成雙鏈的過程。待測DNA樣品DNA探針異源DNA雙鏈建立雜交條件需要考慮的因素離子強(qiáng)度:５xSSCDNA濃度:濃度越高,復(fù)性速度越快DNA探針長度:探針越長,復(fù)性速度越慢雜交溫度：雜交反應(yīng)在低于Tm值15-25

Ｃ溫度下進(jìn)行。一般，探針長500bp，G+C含量為５０％，離子強(qiáng)度為５xSSC；雜交液中不含甲酰胺，Tm值為93.4

Ｃ，雜交溫度68.4

Ｃ，含甲酰胺，Tm值為68.4

Ｃ，雜交溫度43.4

Ｃ提高雜交效率（硫酸葡聚糖、聚乙二醇等）３、洗膜離子強(qiáng)度：0.1xSCC洗膜溫度：低于Tm值5-12

C。探針長500bp，G+C含量42%，離子強(qiáng)度0.1xSSC,不含甲酰胺，Tm值為67

Ｃ，則洗膜溫度為55-62

Ｃ.4、雜交信號的檢測（1）放射性核素探針的檢測：放射自顯影（2）非放射性核素探針的檢測地高辛標(biāo)記探針的檢測生物素標(biāo)記探針的檢測地高辛標(biāo)記探針的檢測抗地高辛抗體－堿性磷酸酶復(fù)合物＋底物（BCIP+NBT)紫色的不溶性化合物生物素標(biāo)記探針的檢測過氧化物酶

＋底物（ＤＡＢ）抗生物素蛋白（卵白素）或鏈親和素）生物素棕褐色不溶性的化合物三、雜交的類型液相雜交：固相雜交：膜固相印跡雜交組織細(xì)胞原位雜交菌落原位雜交（一）膜固相印跡雜交

1、固相支持物的選擇（1）硝酸纖維素膜：在高離子強(qiáng)度下，具有較強(qiáng)的吸附單鏈DNA和RNA的能力：80-100ug/cm2

優(yōu)點(diǎn)：雜交本底較低缺點(diǎn)：結(jié)合不牢固，質(zhì)地較脆，在低鹽濃度下結(jié)合DNA效果不佳，不適用于電轉(zhuǎn)移，對小分子量DNA結(jié)合能力不強(qiáng)。（2）尼龍膜：在低離子強(qiáng)度下，很強(qiáng)的吸附單鏈、雙鏈的DNA或RNA；350-500ug/cm2

優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合牢固，韌性強(qiáng)，可用于重復(fù)雜交，對小分子量DNA結(jié)合能力強(qiáng)，在低鹽濃度下可結(jié)合DNA，適用于電轉(zhuǎn)移。缺點(diǎn)：雜交本底高

2、膜固相雜交的類型

（1）斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交（dotblotandslotblot)：檢測DNA或RNA（定性或半定量）（2）Southern印跡雜交(Southern