單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)樣本

單細(xì)胞測(cè)序一一最值得尖注的測(cè)序技術(shù)101/31生物探索單細(xì)胞測(cè)序I全基因組測(cè)序I轉(zhuǎn)錄組測(cè)序隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞群體的研究已不再能滿足科研需求。單細(xì)胞測(cè)序解決了用導(dǎo)組織樣本測(cè)序或樣本少時(shí)無法解決的細(xì)胞異質(zhì)性難題 ，為科學(xué)家研究解析單個(gè)細(xì)胞的行過去二十幾年里，隨著基因測(cè)序技術(shù)水平的提高以及千人基因組計(jì)劃、癌癥基因組計(jì)劃、Meta?Hit計(jì)劃等重大國(guó)際合作項(xiàng)目的相繼開展，基因組研究日漸被推向高潮。然而，迄今為止使用的測(cè)序材料無一例外都是數(shù)百萬甚至更多細(xì)胞的混合DNA羊本。這種方法能夠得到全基因組序列信息，可是對(duì)其進(jìn)行研究得到的結(jié)果只是一群細(xì)胞中信號(hào)的平均值，或者只代表其中占優(yōu)勢(shì)數(shù)量的細(xì)胞信息，單個(gè)細(xì)胞獨(dú)有的特性被忽視。例如，科學(xué)家想找出哪種突變存在于哪種細(xì)胞中幾乎是不可能的，只存在于少數(shù)細(xì)胞（如早期癌細(xì)胞）中的突變也基本上被掩藏。另一方面，有些樣品稀少無法在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，樣品量不足以進(jìn)行全基因組分析：例如腫瘤循環(huán)細(xì)胞、組織微陣列、早期發(fā)育的胚胎細(xì)胞等。這些都是全基因組測(cè)序遇到的難題。作為"在單個(gè)細(xì)胞水平上對(duì)基因組進(jìn)行測(cè)序的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠解決上述難題。與傳統(tǒng)的全基因組測(cè)序相比，單細(xì)胞測(cè)序不但測(cè)量基因表示水平更加精確：而且還能檢測(cè)到微量的基因表示子或罕見非編碼 RNA,其優(yōu)勢(shì)是全方位和多層次的。,《自然方法》雜志(NatureMethods)W單細(xì)胞測(cè)序列為年度值得期待的技術(shù)之一(1)，，《科學(xué)》雜志(Scienee)將單細(xì)胞測(cè)序列為年度最值得尖注的六大領(lǐng)域榜首⑵。與此同時(shí)，測(cè)序巨頭相繼推出新一代測(cè)序儀，為單細(xì)胞測(cè)序提供利器，越來越多與單細(xì)胞測(cè)序有尖的研究也發(fā)表在頂級(jí)期刊上 ,這些都表明，單細(xì)胞測(cè)序已逐漸成為科研熱點(diǎn)，有望成為最值得尖注的測(cè)序技術(shù)。單細(xì)胞測(cè)序基本路線近年來，流式細(xì)胞分選和激光捕獲顯微切割技術(shù)的出現(xiàn)讓單細(xì)胞的捕獲成為可能。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)正逐漸從實(shí)驗(yàn)研究方法成為指導(dǎo)臨床的有利工具，為基礎(chǔ)研究向臨床轉(zhuǎn)化搭建了橋梁。單細(xì)胞測(cè)序主要涉及單細(xì)胞基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序兩方面，分別針對(duì)單個(gè)細(xì)胞的DNA和RNAS行序列分析和比較，進(jìn)而揭示基因組和轉(zhuǎn)錄組的變化。單細(xì)胞全基因組測(cè)序單細(xì)胞全基因組測(cè)序技術(shù)是在單細(xì)胞水平對(duì)全基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序的一項(xiàng)新技術(shù)。其原理是將分離的單個(gè)細(xì)胞的微量全基因組DNA?行擴(kuò)增,獲得高覆蓋率的完整的基因組之后經(jīng)過外顯子捕獲進(jìn)而高通量測(cè)序用于揭示細(xì)胞群體差異和細(xì)胞進(jìn)化尖系。全基因組擴(kuò)增技術(shù)主要分為兩種類型：一是基于熱循環(huán)以PCR為基礎(chǔ)的擴(kuò)增技術(shù)，如簡(jiǎn)并寡核背酸引物PCRDOP-PCR、連接反應(yīng)介導(dǎo)的PCF(LM-PCR)擴(kuò)增前引物延伸反應(yīng)(PEP)等；一是基于等溫反應(yīng)不以PCF為基礎(chǔ)的擴(kuò)增技術(shù)，如多重置換擴(kuò)增(MDA)和基于引物酶的全基因組擴(kuò)增(pWGA)。在這兩種類型中,PCR擴(kuò)增比較經(jīng)典，可是，對(duì)不同的序列來說，PCR擴(kuò)增的效率存在相當(dāng)大的偏差，易產(chǎn)生擴(kuò)增偏倚問題：女口富含CG的DNA序列和相應(yīng)基因座位的非隨機(jī)丟失，等位基因的非隨機(jī)丟失，以及與DNA片段大小相尖的偏差(傾向于擴(kuò)增更多短片段)，特別是在應(yīng)用于單細(xì)胞時(shí)，大量短片段導(dǎo)致片段間序列丟失，從而使其應(yīng)用受限。MD/是當(dāng)前公認(rèn)的最好的單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)，它能對(duì)全基因組進(jìn)行高保真的均勻擴(kuò)增，擴(kuò)增出10-100kb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因組序列?？墒荕DA也有一些缺點(diǎn)，特別是顯著的非特異擴(kuò)增，往往空白對(duì)照樣品也總是”無中生有”地產(chǎn)生大量的DNA,另外就是依然存在序列偏差。盡管各種改進(jìn)的策略正在逐步減少這些缺陷，高覆蓋率、高保真性及高特異性的擴(kuò)增依然是亟待解決的問題。另外，對(duì)測(cè)序得到的大量數(shù)據(jù)結(jié)果的專業(yè)分析也是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。單細(xì)胞全基因組測(cè)序正在從基礎(chǔ)研究走向臨床應(yīng)用。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析主要用于在全基因組范圍內(nèi)挖掘基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，特別適用于存在高度異質(zhì)性的干細(xì)胞及胚胎發(fā)育早期的細(xì)胞群體。與活細(xì)胞成像系統(tǒng)相結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析更有助于深入理解細(xì)胞分化、 細(xì)胞重編程及轉(zhuǎn)分化等過程及相尖的基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。將此技術(shù)應(yīng)用于臨床，理論上能夠在生理或病理情況下連續(xù)追蹤基因表示的動(dòng)力學(xué)變化，從而監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析的另一應(yīng)用領(lǐng)域是發(fā)現(xiàn)亞細(xì)胞成分的基因表示譜，例如對(duì)在神經(jīng)元的軸突或樹突部分特異表示的基因的轉(zhuǎn)錄組的分析，這些基因往往對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)功能發(fā)揮著重要作用?？墒牵b于當(dāng)前的技術(shù)手段，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序依然存在覆蓋率低的弊端,導(dǎo)致除mRN以外的長(zhǎng)非編碼RNAst以檢測(cè)，而且不能區(qū)分正義鏈與反義鏈。最近發(fā)展的單分子測(cè)序技術(shù)無需逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增步驟而直接對(duì)單個(gè)細(xì)胞的全長(zhǎng)mRNA進(jìn)行測(cè)序，從而準(zhǔn)確地檢測(cè)基因不同的剪切亞型的表示水平。隨著技術(shù)的發(fā)展這些局限性會(huì)被逐步優(yōu)化和改進(jìn)。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)實(shí)例多重退火和成環(huán)循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(MultipleAnnealingandLooping-BasedAmplificationCycles,MALBAC)主要研發(fā)人：哈佛大學(xué)終身教授、美國(guó)科學(xué)院院士謝曉亮(SunneyXie)教授技術(shù)看點(diǎn)：降低PCRT增偏倚，使得單細(xì)胞中93%勺基因組能夠被測(cè)序。這種方法使得檢測(cè)單細(xì)胞中較小的DNA序列變異變得更容易，因此能夠發(fā)現(xiàn)個(gè)別細(xì)胞之間的遺傳差異。這樣的差異能夠幫助解釋癌癥惡化的機(jī)制，生殖細(xì)胞形成機(jī)制，甚至是個(gè)別神經(jīng)元的差異機(jī)制。技術(shù)簡(jiǎn)介：PCRT增具有偏好型而且基因組具有大量的冗余，造成了基因組測(cè)序準(zhǔn)確性不高。謝曉亮研發(fā)的MALBA技術(shù)能從一個(gè)細(xì)胞的基因組中，分離出來自單細(xì)胞的DNA,然后添加稱作引物的短DNA分子。這些引物可與DNA的隨意部分互補(bǔ)，從而使得它們能夠附著到DNA鏈上，充當(dāng)DNA復(fù)制起點(diǎn)。這些引物由兩個(gè)部分構(gòu)成 個(gè)包含8個(gè)核昔酸的粘性部分變化多樣，可與DNA結(jié)合，再加上一個(gè)包含27個(gè)核昔酸的共同序列。這一共同序列可防止 DNA太多次拷貝，大大地降低了擴(kuò)增偏倚。經(jīng)過將自身?yè)饺氲叫驴截愭?，從而自身成環(huán)，防止了過度拷貝。利用這種方法，進(jìn)行與加入的引物的DNA復(fù)制時(shí)，能夠完成高達(dá)93%勺基因組測(cè)序。技術(shù)論文：技術(shù)論文：Genome-WideDetectionofSingle-NucleotideandCopy-NumberVariationsofaSingleHumanCell基于芯片實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的單細(xì)胞測(cè)序主要研發(fā)人：斯坦福大學(xué)StephenQuake技術(shù)看點(diǎn)：基于labonachip開發(fā)技術(shù)簡(jiǎn)介：本技術(shù)設(shè)計(jì)了一種路線,用液體載運(yùn)細(xì)胞經(jīng)過一連串顯微管道和微閥門，當(dāng)細(xì)胞挨個(gè)進(jìn)入各自的小空位時(shí)，它們的DNA就會(huì)被提取出來，經(jīng)過復(fù)制用于進(jìn)一步分析。另外，本技術(shù)不但能分離細(xì)胞，還能用化學(xué)試劑將細(xì)胞混合起來，經(jīng)過檢測(cè)反應(yīng)過程中的熒光發(fā)射獲得它們的基因編碼。所有這些都能在芯片上完成，不但操作簡(jiǎn)單，而且成本效益高。StephenQuake已利用此技術(shù)完成了第一例人類單細(xì)胞測(cè)序，現(xiàn)在她正利用這項(xiàng)技術(shù)研