神經(jīng)生長因子對大鼠脛骨骨折愈合的影響

神經(jīng)生長因子對大鼠脛骨骨折愈合的影響

0骨組織中神經(jīng)纖維的生長骨折修復(fù)是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，是由多種組織和因素共同作用的結(jié)果。神經(jīng)系統(tǒng)對骨折愈合有作用早在150年前就有人通過大體解剖發(fā)現(xiàn)，骨組織中存在神經(jīng)纖維在解剖學(xué)上得到證實(shí)；神經(jīng)生長因子是1952年發(fā)現(xiàn)的，它主要被用于維持交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)纖維存在和促進(jìn)神經(jīng)突起生長的作用。但近年來發(fā)現(xiàn)其在神經(jīng)系統(tǒng)外的作用也很顯著，尤其是隨著神經(jīng)系統(tǒng)對骨折愈合研究的深入，對其在骨組織中的靶細(xì)胞作用的研究更是成為熱門。實(shí)驗(yàn)通過治療性給予脛骨骨折模型大鼠神經(jīng)生長因子觀察其對骨折冶療是否有作用。1骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)設(shè)計(jì)：隨機(jī)對照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。時(shí)間及地點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)于2005-06/2006-03在解放軍第二軍大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成，實(shí)驗(yàn)室生物防護(hù)水平BSL-2。材料：健康雄性3個(gè)月齡SD大鼠120只(中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量250～300g，隨機(jī)分為2組：單純左脛骨骨折組；神經(jīng)生長因子治療組，每組60只。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。注射用神經(jīng)生長因子由廈門北大之路生物工程有限公司提供。實(shí)驗(yàn)方法：脛骨骨折的制備：100g/L水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，折斷脛骨上1/3處，平臺前緣插入克氏針行髓內(nèi)固定，術(shù)后石膏固定。術(shù)后3～5d內(nèi)肌注青霉素(50mg/kg)。神經(jīng)生長因子的配制及應(yīng)用:將每瓶6000U包裝的神經(jīng)生長因子凍干粉(注射用神經(jīng)生長因子)用1mL生理鹽水充分稀釋,參照文后文獻(xiàn)劑量，肌注2000AU(1.4g)，1次/d,分別注射兩側(cè)腓腸肌，連續(xù)肌注2周。骨折后4周處死動(dòng)物取組織標(biāo)本進(jìn)行觀察。生物力學(xué)的3點(diǎn)折彎試驗(yàn)：取大鼠脛骨進(jìn)行3點(diǎn)彎曲試驗(yàn)測定斷裂能量、大鼠脛骨的柔度比、大鼠脛骨愈合時(shí)的相關(guān)力學(xué)性能參數(shù)、大鼠脛骨的愈合強(qiáng)度、大鼠脛骨的愈合剛度。骨痂成骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察：將新鮮骨痂盡可能鋸成1.0～2.0mm3大小放入脫鈣液中，直到用針頭可刺透標(biāo)本，送至解放軍第二醫(yī)科大學(xué)電鏡室制片觀察。Western印跡檢測骨痂中Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)：標(biāo)本脫鈣1周，取脫鈣骨組織按組織裂解法提取蛋白；Bradford法測定蛋白濃度，上樣量60μg，用夾心方法把濾紙，凝膠，硝酸纖維素薄膜依順序放好，插入電轉(zhuǎn)移槽中，并加入電轉(zhuǎn)移緩沖液，100V電壓下轉(zhuǎn)膜100min。取出硝酸纖維素薄膜置入2%BSA/PBST液中37℃封閉2h，加入Ⅰ型膠原的一抗(1∶1500)，4℃冰箱過夜，次日漂洗硝酸纖維素薄膜3次，再加入2抗(1∶2000)，室溫2h,取出再次漂洗3次，用ECLRegentA,RegentB(1∶1)混勻后涂抹于硝酸纖維素薄膜上，反應(yīng)5min；用塑料保鮮膜包裹后固定于壓片匣中，曝光顯影。將X射線膠片置于GelDoc2000圖像分析系統(tǒng)，測定目的條帶的平均吸光度值，并將5次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值作為蛋白含量的相對值。采用生物電泳圖像處理系統(tǒng)對免疫復(fù)合物進(jìn)行分析，以各組產(chǎn)物吸光度值與β-actin吸光度值的比值作為各組產(chǎn)物相對吸光度值。Ⅱ型膠原測定方法同Ⅰ型膠原。主要觀察指標(biāo)：(1)骨折斷端橫截面最大直徑及斷面骨痂灰度值。(2)生物力學(xué)的3點(diǎn)折彎試驗(yàn)結(jié)果。(3)骨組織計(jì)量學(xué)的比效。(4)骨痂組織形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果。(5)骨痂中骨鈣素的表達(dá)。(6)骨痂中成骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。(7)骨痂中Ⅰ型、Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，由第二作者應(yīng)用SARS軟件處理，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1動(dòng)物的數(shù)量分析實(shí)驗(yàn)選用大鼠120只，分為2組，脫失6只，進(jìn)入結(jié)果分析114只。2.2學(xué)性能試驗(yàn)結(jié)果通過2組大鼠脛骨的3點(diǎn)折彎試驗(yàn)，得到大鼠脛骨愈合過程中彎曲力學(xué)性能試驗(yàn)結(jié)果，見表1。結(jié)果表明，神經(jīng)生長因子治療組在彎曲剛度、彎曲強(qiáng)度、彎曲撓度、彎曲載荷彎矩、比撓度λ等6項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于單純左脛骨骨折組，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示差異有顯著性意義(P<0.05)。2.3各組細(xì)胞的平均形態(tài)透射電鏡下見神經(jīng)生長因子治療組成骨細(xì)胞呈突起顯著，細(xì)胞邊緣不光滑，皺折明顯；單純左脛骨骨折組的細(xì)胞突起細(xì)長，細(xì)胞邊緣略有皺折。細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器主要表現(xiàn)在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量及形態(tài)上有不同，神經(jīng)生長因子治療組粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)粗大，擴(kuò)張明顯，可見到數(shù)量多的高爾基體。見圖1。2.4兩組患者治療前后神經(jīng)生長因子治療組p>0.1的比較見表1傷后4周單純左脛骨骨折組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)明顯低于神經(jīng)生長因子治療組(P<0.01)；單純左脛骨骨折組骨痂中Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)明顯高于神經(jīng)生長因子治療組(P<0.05)。見圖2。3神經(jīng)生長因子與骨折愈合的關(guān)系臨床中發(fā)現(xiàn)失神經(jīng)可導(dǎo)致骨折斷端骨痂過度生長甚至在肌肉中出現(xiàn)異位骨化，這一現(xiàn)象提示神經(jīng)因素對骨折愈合有影響。神經(jīng)對骨折愈合影響的研究近年來逐漸成為臨床醫(yī)師和科研人員關(guān)注的重點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明透射電鏡下可見，給予神經(jīng)生長因子后能促進(jìn)成骨細(xì)胞突起，導(dǎo)致細(xì)胞邊緣不光滑，皺折明顯；細(xì)胞內(nèi)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量增多，擴(kuò)張明顯，還可以刺激生長數(shù)量多的高爾基體，這些均為骨折愈合提供物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí)能通過對這些細(xì)胞器的數(shù)量形態(tài)變化的研究來闡釋神經(jīng)生長因子對骨折愈合的影響，提供新的科研思路及治療方法。神經(jīng)生長因子能夠促進(jìn)骨折愈合第4周骨痂中Ⅰ型膠原的分泌，促進(jìn)骨痂中Ⅱ型膠原的吸收，這也許是神經(jīng)生長因子促進(jìn)骨折愈合的原因。骨折引起骨折斷端局部周圍神經(jīng)損傷或部分死亡，導(dǎo)致部分骨折斷端處于失神經(jīng)狀態(tài)。一方面骨折初始靶細(xì)胞因失去神經(jīng)因素的調(diào)控而分泌大量的神經(jīng)營養(yǎng)因子來誘使神經(jīng)纖維長入到骨折區(qū)，另一方面這些神經(jīng)營養(yǎng)因子與骨系細(xì)胞上的受體結(jié)合通過磷酸化增強(qiáng)了骨系細(xì)胞的活性及功能活動(dòng)，表現(xiàn)為分泌更多的細(xì)胞外基質(zhì)如Ⅱ型膠原。隨著骨折斷端愈合過程中由類骨質(zhì)向骨性骨痂轉(zhuǎn)化期，成骨細(xì)胞繼續(xù)得到正常神經(jīng)因素調(diào)控作用，開始分泌Ⅰ型膠原為類骨質(zhì)骨化提供基礎(chǔ)，最終骨折斷端表現(xiàn)為軟骨骨痂骨化。神經(jīng)生長因子治療組骨痂中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)量高于正常骨折組，說明了神經(jīng)生長因子能促成骨細(xì)胞分泌更多的Ⅰ型膠原，促進(jìn)了骨折愈合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Grills等于1989年提出神經(jīng)元與靶細(xì)胞之間的相互依賴學(xué)說相一致，并依該學(xué)說詮釋了神經(jīng)系統(tǒng)對骨折治療的影響。骨折后應(yīng)用神經(jīng)生長因子不僅早期可促Ⅱ型膠原分泌，而且在骨折愈合的第4周為成骨細(xì)胞的提供更多的Ⅰ型膠原,間接地促進(jìn)了骨痂骨化，但其具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。不少研究發(fā)現(xiàn)骨不連及異位骨化的骨組織中少有或沒有神經(jīng)纖維長入，推測神經(jīng)因素可能對骨折后產(chǎn)生骨不連等不良預(yù)后有一定影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)神經(jīng)因素對骨折愈合有明顯影響，神經(jīng)生長因子對骨折愈合有一定促進(jìn)作用，可能為治療骨不連及異位骨化提供了新的方法及思路。>>本文導(dǎo)讀<<課題背景:研究證實(shí)神經(jīng)生長因子可通過促進(jìn)骨折部位神經(jīng)的再生。原來認(rèn)為主要作用于神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)生長因子局部應(yīng)用還可以提高骨折修復(fù)的速度和效率。作者前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長因子有助于失神經(jīng)狀態(tài)下骨折斷端的骨化,實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。應(yīng)用要點(diǎn):生物力學(xué)3點(diǎn)折彎試驗(yàn)驗(yàn)證神經(jīng)生長因子促進(jìn)骨折愈合的作用是最客觀直接的科學(xué)方法。骨痂中成骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)微觀地反映骨折斷端骨痂中細(xì)胞器形態(tài)數(shù)理的變化。運(yùn)用Western印跡檢測骨痂中Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的分析表明,神經(jīng)系統(tǒng)在骨痂生長的不同時(shí)期通過調(diào)節(jié)這2種膠原的量可以調(diào)控骨折的愈合。相關(guān)鏈接:神經(jīng)生長因子對骨折修復(fù)的作用機(jī)制可能為:(1)誘導(dǎo)神經(jīng)纖維長入骨組織,增加骨折部的神經(jīng)支