Gene7-02從基因到基因組

Lecture2FromGenestoGenomes(7)Interruptedgenes(8)Introduction引言RestrictionendonucleasesareakeytoolinmappingDNA通過限制性內(nèi)切作圖Howvariableareindividualgenomes?分子標(biāo)記，分子標(biāo)記作圖與應(yīng)用（？）InterruptedGeneExonsequencesareconservedbutintronsvary

Genescanbeisolatedbytheconservationofexons

基

因在尺寸大小上分布廣泛53斷裂基因是如何發(fā)展進(jìn)化的？58本講主要內(nèi)容Introduction1993NobelRichardJ.RobertsandPhillipA.SharpGenomic2.2

RestrictionendonucleasesareakeytoolinmappingDNA

Wecanthinkaboutmappinggenesandgenomesatseverallevelsofresolution:

Geneticmap

Acytogenetic

Agenetic(orlinkage)mapidentifiesthedistancebetweenmutationsintermsofrecombinationfrequencies.

AlinkagemapcanalsobeconstructedbymeasuringrecombinationbetweensitesingenomicDNA.

Physicmap

ArestrictionmapisconstructedbycleavingDNAintofragmentswithrestrictionenzymesandmeasuringthedistancesbetweenthesitesofcleavage.

Transceiptionmap

TheultimatemapistodeterminethesequenceoftheDNA.Fromthesequence,wecanidentifygenesandthedistancesbetweenthem.A

restrictionmaprepresentsalinearsequenceofthesitesatwhichparticularrestrictionenzymesfindtheirtargets.Distancealongsuchmapsismeasureddirectlyinbasepairs(abbreviatedbp)forshortdistances;longerdistancesaregiveninkb,correspondingtokilobase(103)pairsinDNAortokilobasesinRNA.Atthelevelofthechromosome,amapisdescribedinmegabasepairs(1Mb=106bp).我們現(xiàn)在可以制作一個(gè)完整的5000bp區(qū)域圖譜。前面那長(zhǎng)張圖顯示了特異的限制性酶切DNA的位置，這些切點(diǎn)的距離由堿基對(duì)進(jìn)行測(cè)量。這樣DNA被分割成一系列由限制性酶決定的確定長(zhǎng)度的區(qū)域，這些長(zhǎng)度區(qū)域由限制酶切割。2.2RestrictionendonucleasesareakeytoolinmappingDNA

32.

Restrictionmapping5000bp長(zhǎng)的DNA分子由兩個(gè)限制性酶A和B切成片段，而后DNA進(jìn)行電泳。每一條片段的大小由已知大小的片段的位置來決定，如中部所示。酶A將DNA切成4段(長(zhǎng)為2100，1400，1000，500pb)，酶B切為3段(長(zhǎng)為2500，1300，1200bp)。那么是否能根據(jù)這些數(shù)據(jù)制作一個(gè)圖譜，來顯示DNA分子的特定的斷裂點(diǎn)呢？雙單酶切做physicalmap真正構(gòu)建限制性圖譜時(shí)需要許多酶，所以解決由各種各樣酶產(chǎn)生的十分復(fù)雜的覆蓋片段是十分必要的。許多更進(jìn)一步的技術(shù)就用來構(gòu)建圖譜。另一種方法是用部分（酶切）消化，通過在一些條件下，一種酶并不確認(rèn)每一種DNA分子的目標(biāo)切點(diǎn)而是不能在目標(biāo)切點(diǎn)上進(jìn)行切除。這種條件可以設(shè)置，這樣這種酶有一個(gè)特殊的可能性，例如，只切它所識(shí)位點(diǎn)的50％。單酶切也可實(shí)現(xiàn)作圖單酶切也可實(shí)現(xiàn)作圖應(yīng)用單酶切不完全消化技術(shù)，酶A可能產(chǎn)生3500，3100，1400bp等的分裂片段，通過比較完全消化的部分產(chǎn)品，1000-2100bp片段可被認(rèn)作3100bp部分片段的鄰近成分。同樣，2100，1400bp片段可被置于3500bp部分片段作為鄰近成分。這樣該技術(shù)允許單切酶切點(diǎn)按序排列。如果一種酶的兩個(gè)些切點(diǎn)離得非常近（比如，小于50bp），則所產(chǎn)生的非常小的片段就在瓊脂糖凝膠上丟失。當(dāng)然，當(dāng)其它片段的分子量相加時(shí)，這種情況會(huì)導(dǎo)致脫節(jié)。這個(gè)問題可以通過應(yīng)用其他一些限制性酶來構(gòu)建圖譜而被克服掉，所以用不同酶產(chǎn)生的片段中有總夠的覆蓋來保證所有的DNA都被包含進(jìn)來。另一有用技術(shù)是末端標(biāo)記，而DNA分子的末端用放射性P元素進(jìn)行標(biāo)記（一定的酶可將P單元特定地加到5`或3`端）。這允許了包含末端的片段由于放射標(biāo)記而被識(shí)別。這樣在片段A準(zhǔn)備中，A-1000，A-500將迅速置于圖譜兩端，片段B-1200，B-1300將被認(rèn)為是末端片段。通過用末端標(biāo)記技術(shù)比較部分酶切消化，一系列的由一種酶所確定的切點(diǎn)可以直接相對(duì)末端而在圖上做出來，圖2.4顯示了僅由它們放射性的標(biāo)記末端而識(shí)別出的片段，那些分子內(nèi)的切點(diǎn)被忽略掉，然后而一系列片段確定了距標(biāo)記末端的每一個(gè)切點(diǎn)。如果圖6.4的左端5000bp片段被做上標(biāo)記，酶A的部分?jǐn)嗔褜⒘⒓创_定出距末段的1000，3100，4500bp切點(diǎn)。Figure2.4Whenrestrictionfragmentsareidentifiedbytheirpossessionofalabeledend,eachfragmentdirectlyshowsthedistanceofacuttingsitefromtheend.Successivefragmentsincreaseinlengthbythedistancebetweenadjacentrestrictionsites.2.2RestrictionendonucleasesareakeytoolinmappingDNA

1000，3100，4500bpDNA結(jié)構(gòu)在不同種類的生物體內(nèi)存在著相當(dāng)大的差異隨著對(duì)基因及基因組認(rèn)識(shí)的不斷深入，發(fā)現(xiàn)同種的不同個(gè)體之間，盡管其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能完全相同或僅有微小差異，但在DNA水平卻存在著差異或明顯差異，尤其在不編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域以及沒有重要調(diào)節(jié)功能的區(qū)域表現(xiàn)更為突出。DNA順序上的大多數(shù)突變是中性突變，即不影響生物體的表型，因而過去長(zhǎng)期對(duì)這些突變不太重視，也無法用傳統(tǒng)的遺傳學(xué)方法來研究。2.3Howvariableareindividualgenomes?個(gè)體基因組如何變化?(thoughHPG)Forexample,youandme與酶切有關(guān)(小基因組）分子操作技術(shù)的不斷發(fā)展，從DNA水平上直接分析生物體的突變成為可能。假如DNA順序中的某個(gè)堿基發(fā)生了突變，尤其是在某種限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)(突變或缺失)。這樣，利用該限制性內(nèi)切酶消化此DNA時(shí)，便會(huì)產(chǎn)生與正常不同的限制性片段。這樣，在同種生物的不同個(gè)體中會(huì)出現(xiàn)不同長(zhǎng)度的限制性片段類型，即限制性片段多態(tài)性（RFLP）。其他的顯示DNA差異（多態(tài)性的）？分子標(biāo)記構(gòu)建高分別率遺傳圖譜(80年代,Botsein提出DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)可以作為遺傳標(biāo)記,從此開創(chuàng)了直接應(yīng)用DNA多態(tài)的新階段.90年代,DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的發(fā)展,使直接擴(kuò)增DNA的多態(tài)性成為可能,并在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生了許多種新型分子標(biāo)記,諸如擴(kuò)增片段多態(tài)性(ALFR)、串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)，RAPD是較為突出的一種.SNP單鏈構(gòu)型多態(tài)性(PCR-SSCP)、序列特異擴(kuò)增區(qū)域(SCAR).限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性的分類RFLP分為兩類型：一類是由于限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)上發(fā)生了單個(gè)堿基突變而使這一限制性位點(diǎn)發(fā)生丟失或獲得而產(chǎn)生的多態(tài)性，故稱之為點(diǎn)多態(tài)性（pointpolymorphism

）。這類多態(tài)性實(shí)際上是雙態(tài)的，即有（+

）或無（-

）。另一類是由于DNA分子內(nèi)部發(fā)生較大的順序變化所致。這一類多態(tài)性又可以分成兩類：第一類是由于DNA順序上發(fā)生突變?nèi)缛笔?、重?fù)、插入所致。反映的是在RLFP多態(tài)

第二類是所謂“高變區(qū)”。高變區(qū)（highlyvariableregion），是由多個(gè)串聯(lián)重復(fù)順序組成的，不同的個(gè)體高變區(qū)內(nèi)所串聯(lián)重復(fù)的拷貝數(shù)相差懸殊，因而高變區(qū)的長(zhǎng)度變化很大，從而使高變區(qū)兩側(cè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的固定位置隨高變區(qū)的大小而發(fā)生相對(duì)位移。所以這一類型的RFLP是由于高變區(qū)內(nèi)串聯(lián)重復(fù)順序的拷貝數(shù)不同所產(chǎn)生的，其突出特征是限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)本身的堿基沒有發(fā)生改變，改變的只是它在基因組中的相對(duì)位置。即可反映在RLFP上，也可PCR擴(kuò)增高變區(qū)DNA與DNA指紋人的衛(wèi)星DNA或稱隨體DNA是由一些短的DNA片段（10bp左右）多次重復(fù)所構(gòu)成的。重復(fù)片段的組成和拷貝數(shù)在不同的個(gè)體及基因組的不同位置上不一樣。DNA指紋的圖譜取決于所用探針的核心序列（即重復(fù)序列中的重復(fù)單位）。目前所用的探針有兩種，即探針33.5。其核心序列為

AGAGGTGGGCAGGTGG,

33.6，即AGGGCTGGAGG。這就是說這兩種序列在人體基因組中不同的位置上分別重復(fù)不同的次數(shù)，而在不同個(gè)體的基因組中，對(duì)應(yīng)位置上這兩種核心序列的重復(fù)次數(shù)也不相同。這樣用這兩種探針之一與合適的酶切割的人體基因組DNA片段雜交，在不同的個(gè)體將得到不同的DNA指紋，而且探針33.5的DNA指紋圖也不相同。DNA指紋具有細(xì)胞穩(wěn)定性和種系穩(wěn)定性，是按孟德爾規(guī)律遺傳的，而且雜合性高。對(duì)于由點(diǎn)突變引起的RFLP，就某一個(gè)多態(tài)性切點(diǎn)來說只有兩種多態(tài)性，即切點(diǎn)有（+）或切點(diǎn)無（-）。而對(duì)由于高變區(qū)重復(fù)片段長(zhǎng)度不同所引起的RFLP來說，在基因組上某一個(gè)位置核心序列的重復(fù)次數(shù)在不同的個(gè)體不一樣，比如在個(gè)體Ａ為10個(gè)拷貝，個(gè)體Ｂ為15個(gè)拷貝，而個(gè)體Ｃ又可能為18個(gè)拷貝等等。因此，在不同個(gè)體同一個(gè)相應(yīng)位置上核心序列的重復(fù)次數(shù)就是多態(tài)的，而不是雙態(tài)的。即使在基因組上的某一個(gè)位置處核心序列的次數(shù)一樣，從而被酶切出的長(zhǎng)度相同，但在基因組的其他位置上該核心序列重復(fù)次數(shù)又可能不同。由于DNA指紋是按孟德爾規(guī)律遺傳的，子代的DNA指紋圖可以追溯到其父母DNA指紋圖上，而在不是其父母的DNA指紋圖上則很難找到與其一樣的小隨體DNA片段。在父親的5條可分辨的小隨體DNA片段中，有4條處于雜合狀態(tài)，即這4條DNA片段有不同的個(gè)體長(zhǎng)度。因此，因高變區(qū)核心序列重復(fù)次數(shù)不同引起的RLFP才是真正的多態(tài)性。在不同個(gè)體，這種RLFP即DNA指紋可以說不存在相同的。即使使用一種探針產(chǎn)生的DNA指紋圖無法鑒定這兩個(gè)個(gè)體，如再用另一種探針便有可能將這兩個(gè)個(gè)體區(qū)分開。DNA指紋技術(shù)已被應(yīng)用于親子鑒定和法醫(yī)學(xué)上對(duì)罪犯的確認(rèn)等領(lǐng)域。Haplotype（單元型，單倍型一條染色體或DNA分子的基因型）

istheparticularcombinationofallelesinadefinedregionofsomechromosome,ineffectthegenotypeinminiature.OriginallyusedtodescribedcombinationsofMHCalleles,itnowmaybeusedtodescribeparticularcombinationsofRFLPs.

豐富的多態(tài)性（或高頻率）意味著每個(gè)個(gè)體有獨(dú)特的限制性位點(diǎn)。在特殊區(qū)域發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)組合稱為單體型(Haplotype)。單體型概念最初用于描述主要組織兼容性座位(編碼在免疫系統(tǒng)中很重要的蛋白質(zhì)區(qū)域，見第24章)的遺傳組成?，F(xiàn)在延伸到描述基因組限定區(qū)域的等位基因或限制性位點(diǎn)(或者任何其他遺傳標(biāo)記)的特殊組合。

(個(gè)體某些位點(diǎn)或基因的組成)

2.3Howvariableareindividualgenomes?個(gè)體基因組如何變化?SNP

(singlenucleotidepolymorphism)isanysiteatwhichasinglenucleotidehaschangedwhentwo(haploid)genomesarecompared.SNPsandHaplotypesASingleNucleotidePolymorphism(SNP),pronouncedsnip,is

asingleDNAbasevariationobservedinthehumanpopulation.AhaplotypestandsforasetoflinkedSNPsonthesamechromosome.SNP1SNP2SNP3-ACTTAGCTC--AATTTGCTC--ACTTTGCTT--ACTTTGCTC-Haplotype2Haplotype3CACATCCTTHaplotype1SNP1SNP2SNP3Haplotype4CTCSNP，RLFP，VTRP實(shí)際上，在DNA順序中，存在著大量的單個(gè)堿基的替換，但用通常所用的技術(shù)只能檢測(cè)出影響到限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上的突變。不同的多態(tài)性切點(diǎn)在一特定人群中出現(xiàn)（+）的頻率不一樣。一段DNA，切點(diǎn)Ａ=0.6（即60％的人含有該切點(diǎn)，而另外40％的人在同一位點(diǎn)處不含該切點(diǎn)）；切點(diǎn)Ｂ=0.4。隨機(jī):Ａ、Ｂ同時(shí)存在（++）0.6×0.4=0.24,即24％的人同時(shí)含有Ａ、Ｂ兩個(gè)切點(diǎn)。非隨機(jī)相關(guān)的，那么同時(shí)存在的可能性將和預(yù)期的頻率相差較大。這種相關(guān)的非隨機(jī)性稱為:連鎖不平衡。n，2n組合，每種組合稱為一種單元型，每種單元型隨機(jī)相關(guān)的預(yù)期出現(xiàn)頻率為各個(gè)位點(diǎn)頻率乘積。但是，實(shí)踐證明多態(tài)性切點(diǎn)之間并非隨機(jī)相關(guān)。例如，在β珠蛋白基因簇內(nèi)多態(tài)性切點(diǎn)2到9共8個(gè)，理論應(yīng)有28=256種組合，即256種單體型。但實(shí)際上有3種單體型在希臘、意大利和亞洲印度人βA染色體（攜帶正常β－珠蛋白基因的染色體）中就有94％，而有些理論上的組合在實(shí)際上卻是不存在的。在理論上，單體型（從切點(diǎn)2到9）的頻率為0.46×0.48×0.7×0.27×0.83×0.52×0.37×0.32=0.0021,而實(shí)際上該單體型的頻率為0.64，兩者相差甚大。這說明各個(gè)多態(tài)性切點(diǎn)之間是非隨機(jī)相關(guān)的（連鎖不平衡）。Mappinghumangenesbylinkageanalyisis Physicaldist. Geneticdist.Chromosome1: 283Mb 270cM(0.95cM/Mb)qarmofchromosome21: 30Mb 62cM(2.1cM/Mb)Humangenome 3200Mb

3615cM(1.13cM/Mb)Femalegenome 4460cMMalegenome

2590cMLinkageequilibriumanddisequilibriumDA=Da=f(D)*f(A)or(a)dA=da=f(d)*f(A)or(a)DA=\=Da=\=f(D)*f(A)or(a)dA=\=da=f(d)*f(A)or(a)-Ratioformgeneticdistancetobasepairsrangefrom0.01cM/Mbto60cM/MbLinkageequilibriumanddisequilibrium90%ofallSNPsaresharedamongdisparatepopulationsAfricanpopulationshavesmallersblocks(average7.3kb)comparedwith16.3kbinEuropeanswhereastheChineseandJapaneseblockshaveanaveragesizeof13.2kb.

Whatdoyouusewiththesemarkers?CandidategeneanalysisBasedonpriorlocalizationinformationfromaffectedfamiliesGenome-widescan定位克隆輔助選擇疾病診斷。。。。。分子標(biāo)記的重要作用:·為發(fā)現(xiàn)疾病提供了診斷過程。有些遺傳描述詳細(xì)但是分子機(jī)制描述困難的人類疾病很難診斷，如果一個(gè)限制性片段與表型可靠地相關(guān)，那么它的存在可用來診斷該種疾病，無論是在出生以前還是出生后?！榉蛛x基因提供依據(jù)。如果兩個(gè)位點(diǎn)很少或者從不重組，在遺傳圖譜中限制性片段應(yīng)該距離基因相對(duì)很近。盡管遺傳中“相對(duì)很近”用DNA堿基對(duì)表示可能是有一定距離，但它提供了一個(gè)使我們沿著DNA找到基因的起點(diǎn)。RELPs在人類基因組內(nèi)發(fā)生頻繁，對(duì)遺傳作圖是很有用。但HapMapCatalogofcommonhumangeneticvariationacrossthegenome“Common”wastakentomeanthatthemorerareallelewasinatleast5%ofthepopulation1MillionSNPsweregenotypedin269samplescomprising4populationsAssociationsbetweenSNPshavebeenidentifiedandcataloguedMarkerSelectionforWholeGenomeStudiesUsinginformationfromtheHapMap,itispossibletoselectasetof~300,000-600,000SNPsthatwillrepresentallvariationinthegenomeUsingarraytechnologies,itispossibletogenotypethismanySNPsatoncebasedonCommonDisease-CommonVariantHypothesisMultiplePopulationsTheDNAsamplesfortheHapMaphavecomefromatotalof270people.TheYorubapeopleofIbadan,Nigeria,provided30setsofsamplesfromtwoparentsandanadultchild(eachsuchsetiscalledatrio).InJapan,45unrelatedindividualsfromtheTokyoareaprovidedsamples.InChina,45unrelatedindividualsfromBeijingprovidedsamples.ThirtyU.S.triosprovidedsamples,whichwerecollectedin1980fromU.S.residentswithnorthernandwesternEuropeanancestrybytheCentred'EtudeduPolymorphismeHumain(CEPH).大量的SNP連鎖不平衡構(gòu)成了豐富多態(tài)性ThehapMap(haplotypemapPost-genome確定限制性圖譜的突變點(diǎn)更困難一些。偶然它們將改變限制性酶的目標(biāo)切點(diǎn)，但它們就保持不可探測(cè)性，因?yàn)橄拗菩云蔚脑谝吧秃屯蛔冃捅３种瑯哟笮?。有時(shí)，探測(cè)通過它們對(duì)單鏈DNA較短的片段的移動(dòng)的影響是可以探測(cè)其順序變化的，在一項(xiàng)叫作單鏈構(gòu)型多態(tài)性（SSCP）的技術(shù)即可達(dá)到此項(xiàng)目的。但是在DNA更大區(qū)域內(nèi)尋找堿基替代物時(shí)，決定核苷酸DNA的順序?qū)⒎浅１匾?。聚合酶鏈反?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SingleStrandConformationPolymorphismAnalysisofPolymeraseChainReactionProducts,PCR-SSCP）是近年來發(fā)展起來的一種基因分析方法。

PCR-SSCP分析的基本程序?yàn)椋菏紫萈CR擴(kuò)增特定靶序列，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性為單鏈，進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。相同長(zhǎng)度的DNA單鏈其序列不同，甚至單個(gè)堿基不同，所形成的構(gòu)象不同，電泳遷移率也不同。PCR產(chǎn)物變性后，單鏈產(chǎn)物經(jīng)中性聚丙烯酰胺凝膠電泳，靶DNA中含單堿基置換，或數(shù)個(gè)堿基插入或缺失等改變時(shí)，因遷移率變化會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)變位，從而可將變異DNA與正常DNA區(qū)分開。PCR-SSCP分析技術(shù)是一種DNA單鏈凝膠電泳技術(shù)，該技術(shù)已被廣泛用于癌基因和抗癌基因變異的檢測(cè)、高分別率的分子標(biāo)記遺傳圖譜Usingmicrosatelliterepeatsasmolecularmarkersformapping.Ahybridizationpatternisshownforafamilywithsixchildren,andthispatternisinterpretedatthetopoftheillustrationwiththeuseoffourdifferent-sizedmicrosatellite“alleles,”M′throughM′′′′,oneofwhich(M′′)isprobablylinkedincisconfigurationtothediseaseallele

P.

Fourallelesforarestrictionmarkerarefoundinallpossiblepairwisecombinations,andsegregateindependentlyateachgeneration.PhotographkindlyprovidedbyRayWhite.圖2.7限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)可以按孟德爾方式遺傳，四種等位基因在每代中獨(dú)立地分離，但圖中經(jīng)限制消化后所有Figure2.7RestrictionsitepolymorphismsareinheritedaccordingtoMendelianrules.Figure2.8

Arestrictionpolymorphismcanbeusedasageneticmarkertomeasurerecombinationdistancefromaphenotypicmarker(suchaseyecolor).ThefiguresimplifiesthesituationbyshowingonlytheDNAbandscorrespondingtothealleleoftheothergenomeinadiploid.

圖2.8可用限制酶多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記，測(cè)量?jī)蓚€(gè)重組子表型(如眼睛的顏色)所對(duì)應(yīng)的遺傳學(xué)距離。圖2.8中做了簡(jiǎn)化，僅將有關(guān)的等位基因列出。Figure2.9

Ifarestrictionmarkerisassociatedwithaphenotypiccharacteristic,therestrictionsitemustbelocatednearthegeneresponsibleforthephenotype.

圖2.9如果某限制性標(biāo)記與一個(gè)表型相關(guān)，則該限制酶位點(diǎn)必定位于決定此表型的基因附近。圖中，突變將正常人普遍存在的帶轉(zhuǎn)換成病人中普遍存在的帶。Themutationchangingthebandthatiscommoninnormalpeopleintothebandthatiscommoninpatientsisverycloselylinkedtothediseasegene.Figure2.13Allfunctionalglobingeneshaveaninterruptedstructurewiththreeexons..2.4Organizationofinterruptedgenesmaybeconservedinterruptionsoccurathomologouspositionsinallknownactiveglobingenes：mammals,birds,andfrogs.Thefirstshort,andthesecondlonger,buttheactuallengthscanvary.Mostofvariationfromthesecondintron.Inthemouse,thesecondintronintheα-globingeneisonly150bplong,tatol850bp,comparedwiththemajorβ-globingenewheretheintronlengthof585bpgivesthegeneatotallengthof1382bp.ThevariationinlengthofthegenesismuchgreaterthantherangeoflengthsofthemRNAs(α-globinmRNA=585bases,β-globinmRNA=620bases).

Introntypes，universalandconservationAllclassesofgenesmaybeinterrupted:nucleargenescodingforproteins,nucleolargenescodingforrRNA,andgenescodingfortRNA.Interruptionsalsoarefoundinmitochondrialgenesinlowereukaryotes,andinchloroplastgenes.Interruptedgenesdonotappeartobeexcludedfromanyclassofeukaryotes,andhavebeenfoundinbacteriaandbacteriophages,althoughtheyareextremelyrareinprokaryoticgenomes.2.4Organizationofinterruptedgenesmaybeconserved高等真核生物多數(shù)基因都有內(nèi)含子，沒有內(nèi)含于的僅占極少數(shù)。裂殖酵母較多釀酒酵母只有少數(shù)基因有內(nèi)含子，大腸桿菌T4噬菌體、枯草桿菌spo1噬菌體和藍(lán)細(xì)菌少數(shù)基因有內(nèi)含子。線粒體、葉綠體基因也有內(nèi)含子。不但編碼蛋白質(zhì)的基因有，編碼tRNA的基因也有內(nèi)含子。不同生物的同一基因，內(nèi)含子長(zhǎng)度盡管變化很大，但數(shù)目、位置往往相同。一般,一內(nèi)含子序列不會(huì)見之于另一內(nèi)合子，而外顯子則往往和蛋白質(zhì)的功能性結(jié)構(gòu)域相對(duì)應(yīng)。因此曾設(shè)想內(nèi)含子對(duì)于外顯子重新組合以促進(jìn)基因大步伐進(jìn)化起著重要作用。由于內(nèi)含子中信息量小，在此處改組(shuffling)，不會(huì)危及外顯子的功能結(jié)構(gòu)域。此看法是認(rèn)為一切生物原來都有內(nèi)含子，以后不斷進(jìn)化，原核生物由于基因組小、復(fù)制快，內(nèi)含子成為快速?gòu)?fù)制的包袱，因此逐漸失去。不同生物同一基因的內(nèi)含子數(shù)目、位置一致，是其旁證。與此相反的一種看法認(rèn)為生物本來沒有內(nèi)含子，內(nèi)含子是由于外顯子改組位置不準(zhǔn)確而來的。所以原核生物內(nèi)含子極少，低等真核生物少，高等真核生物多.酵母細(xì)胞色素c基因無內(nèi)含子，而人、鼠有之。內(nèi)含子回歸與傳染這又是個(gè)雞生蛋、蛋生雞的問題。因此，自然而然地出現(xiàn)了中問路線。孰是孰非，一時(shí)難于作出正確判斷。內(nèi)含子按其連接位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和剪接方式來分，可以分為三類，即I類、II類和一般核Pre-mRNA類。I類:4個(gè)保守序列2個(gè)不大保守序列E-E’P(AUGGUGG-AAA),排列:Q(AAUCAGCAGG),5’-E-P-Q-R-E’-S-3’R(UCAGAGACUACA),真菌線粒體/葉綠體/四膜蟲rRNAS(AAGAUAUAGUCC)/T偶數(shù)噬菌體II類:少數(shù)真菌線粒體/大多數(shù)葉綠體/植物線粒體70個(gè)II類內(nèi)含子分析:6個(gè)區(qū)IABC(C1/C2)D(D1/D2)IIIII……..VIII類內(nèi)含子按其大小和結(jié)構(gòu)來說，又可分為普通的II類、III類和孿生內(nèi)含子(twintron)三類。II類內(nèi)含子比較大，可達(dá)600核苷酸以上，有6個(gè)結(jié)構(gòu)域。III類內(nèi)含子可以看作是II類的缺失突變體，除II類的結(jié)構(gòu)域VI保持完整外，結(jié)構(gòu)域I、Il、III、IV、V可以缺失，因此比II類內(nèi)含子小很多，一般不超過150個(gè)核苷酸。孿生內(nèi)含子是在III類內(nèi)含子(稱為外內(nèi)合子，)結(jié)構(gòu)域VI的上游，插入了另一個(gè)甚至幾個(gè)II類(也有I類)內(nèi)含子(稱為內(nèi)內(nèi)含子)。其實(shí)由兩個(gè)I類內(nèi)含子組成的孿生內(nèi)含子也是有的。原生動(dòng)物有I類內(nèi)含子。最近報(bào)道小球藻的病毒編碼蛋白質(zhì)(和TFIIS同源)的基因和14.2kDa可讀框有I類內(nèi)含子。各類內(nèi)含子剪接的共同點(diǎn)是二步轉(zhuǎn)酯鍵反應(yīng)；不同點(diǎn)是I類、Il類都是自我剪接，一般核pre-mRNA類則得有剪接體參加；Il類和核pre—mRNA的剪接都有套索中間體。以前以為只有線粒體和葉綠體才有II類內(nèi)含子。后來按II類內(nèi)含子中員為保守的序列合成引物，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從葉綠體的祖先藍(lán)細(xì)菌和線粒體的祖先紫細(xì)菌都擴(kuò)增、克隆到了II類內(nèi)含子.因此，認(rèn)為現(xiàn)代核基因內(nèi)含子可能來源于II類內(nèi)含子。從剪接反應(yīng)的立體化學(xué)來看，Pre—mRNA的剪接和II類內(nèi)含子的剪接相似。但三類內(nèi)含子剪接是否有進(jìn)化上的聯(lián)系，迄今還沒有明確的答案。有些pre-tRNA也有內(nèi)含子。由于pre-tRNA的結(jié)構(gòu)相對(duì)恒定，內(nèi)含子位置一定，剪接的信息不在內(nèi)含子而在外顯子，剪接由酶進(jìn)行，與上面三類內(nèi)含子剪接的關(guān)系很小。

GT-AG

有些基因的外顯子不但被內(nèi)含子隔開，而且彼此相距甚遠(yuǎn)。例如，地錢的葉綠體核糖體蛋白s12基因由3個(gè)外顯子組成；3‘端的兩個(gè)外顯子由一股DNA編碼，5’端的外顯子由另一股DNA編碼；兩者相距30kb，萊茵衣藻MA基因的三個(gè)外顯子分別相距50、90kb；這類pre—mRNA要經(jīng)過反式剪接，才能成為成熟的mRNA。錐蟲只有反式剪接，線蟲有10一15％的Pre—mRNA是反式剪接；甚至同一基因、既可順式、又可反式剪接，得到不同的mRNA。內(nèi)含子由此一基因轉(zhuǎn)移到另一基因，稱為轉(zhuǎn)座。用PCR法證明酵母線粒體II類內(nèi)含子al1轉(zhuǎn)座到cox1。Podosporaanserina線粒體cox1基因的II類內(nèi)含子a轉(zhuǎn)座到tRNAIle基因和tRNASer基因之間。Figure2.14MammaliangenesforDHFR(dihydrofolatereductase)

.geneisorganizedinto6exonsthatcorrespondtothe2000basemRNA.ButtheyextendoveramuchgreaterlengthofDNAbecausetheintronsareverylong.Inthreemammalstheexonsremainessentiallythesame,andtherelativepositionsoftheintronsareunaltered,butthelengthsofindividualintronsvaryextensively,resultinginavariationinthelengthofthegenefrom25-31kb.2.5Exonsequencesareconservedbutintronsvary外顯子序列保守，內(nèi)含子序列多變比較大的基因DHFR球蛋白和DHFR基因說明了一個(gè)普遍現(xiàn)象：那些在進(jìn)化過程中相關(guān)的基因有著相類似的結(jié)構(gòu)，至少包括了一些內(nèi)含子位置的保守性，基因長(zhǎng)度的變化主要取決于內(nèi)含子長(zhǎng)度的變化。結(jié)構(gòu)基因在其基因組中是獨(dú)特的嗎？答案可能是模棱兩可的。既是又不是整個(gè)基因的長(zhǎng)度是獨(dú)特的，但其外顯子通常與其它基因外顯子相關(guān)。一般而言，當(dāng)兩個(gè)基因是相關(guān)的，它們外顯子的關(guān)系比內(nèi)含子的關(guān)系更緊密。在特殊情況下，兩個(gè)基因的外顯子可能編碼同一個(gè)蛋白質(zhì)，但其內(nèi)含子可能不同。說明這兩個(gè)基因可能起源于一個(gè)共同的祖先基因，拷貝間內(nèi)含子差異積累，但因編碼蛋白質(zhì)功能的需要，其外顯子區(qū)域是保守。外顯子可能是基因進(jìn)化的基礎(chǔ)，它們可以通過不同的方式進(jìn)行組合。一個(gè)基因可能含有幾個(gè)與其他基因相關(guān)的外顯子，但也存在一些并不相關(guān)的外顯子。一般而言，此時(shí)其內(nèi)含子也不相關(guān)。這些基因可能是由同一些外顯子經(jīng)復(fù)制和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的。兩個(gè)基因的相似性可用點(diǎn)陣作圖進(jìn)行比較(圖2.15)。一個(gè)點(diǎn)表明該位置上基因的序列相同。如果兩個(gè)序列完全相同，則點(diǎn)組成一條45度的直線。若存在不相似區(qū)，則直線會(huì)被打斷，并且另一個(gè)相關(guān)序列的缺失或插入會(huì)使其平行或垂直地被替換。Figure2.15Thesequencesofthemouse

majand

minglobingenesarecloselyrelatedincodingregions,butdifferintheflankingregionsandlargeintron.

Thelinepetersoutintheflankingregionsandinthelargeintron

Thisisatypicalpattern,inwhichcodingsequencesarewellrelated,therelationshipcanextendbeyondtheboundariesoftheexons,butitislostinlongerintronsandtheregionsoneithersideofthegene.內(nèi)含子趨異的模式也包括大小的變化(由插入和缺失產(chǎn)生)以及堿基組成。內(nèi)含子比外顯子進(jìn)化快。當(dāng)不同種間的基因進(jìn)行比較，有時(shí)其外顯子同源，而內(nèi)含子間變化巨大，甚至不存在任何相關(guān)序列。外顯子和內(nèi)含子中突變率是相同的，但在外顯子中經(jīng)過選擇使突變被更有效地剔除。如此相反，內(nèi)含子不受編碼功能的限制，其自由積累點(diǎn)突變和其他變異更快。這暗示內(nèi)含子沒有序列特意性功能，其存在對(duì)基因是否是必要的目前尚無定論。GenescanbeisolatedbytheconservationofexonsSupposeweknowbygeneticdatathataparticulargenetictraitislocatedinagivenchromosomalregion.Ifwelackknowledgeaboutthenatureofthegeneproduct,howarewetoidentifythegeneinaregionthatmaybe(forexample)>1Mb?Zooblot

describestheuseofSouthernblottingtotesttheabilityofaDNAprobefromonespeciestohybridizewiththeDNAfromthegenomesofavarietyofotherspecies.2.6Genescanbeisolatedbytheconservationofexons可利用保守的外顯子分離基因Figure2.17AzooblotwithaprobefromthehumanYchromosomalgenezfyidentifiescross-hybridizingfragmentsonthesexchromosomesofothermammalsandbirds.ThereisonereactingfragmentontheYchromosomeandanotherontheXchromosome.DatakindlyprovidedbyDabidPage.2.6Genescanbeisolatedbytheconservationofexons鑒定基因的主要方法大都以外顯子的保守性和內(nèi)含子的多變性比較為基礎(chǔ)。一個(gè)功能在不同種內(nèi)是保守的基因，其代表的蛋白質(zhì)序列應(yīng)該有兩個(gè)性質(zhì)：具有一個(gè)開放讀框，并與其他種屬有相關(guān)的序列。這些特點(diǎn)可以用來分離基因。圍饒的一個(gè)克隆開始，沿著染色體這個(gè)區(qū)域步移(ChromosomeWalking)，從文庫(kù)中鑒定重復(fù)基因(如圖2.16)。Westartwithaclonethatliesinthegeneralvicinityofthisregionandthenwe"walk"throughtheregionbyidentifyingoverlappingclonesfromalibrary.AsshowninFigure2.16,asubfragmentfromoneendofthefirstcloneisusedtoisolateclonesthatextendfartheralongthechromosome.Theseclonesinturnareusedtoisolatethenextset.Ineachcycle,anewcloneisselectedbecauseitsrestrictionmapcoincidesatoneendwiththeendofthepreviousclone,butattheotherendhasnewmaterial.Itispossibletowalkforhundredsofkb,typicallyatarateof>100kbpermonth.Chromosomewalkingallowslargecontiguousregionsofthechromosometoberepresentedinalibraryofclones.Figure2.16Chromosomewalkingisaccomplishedbysuccessivehybridizationsbetweenoverlappinggenomicclones.2.6Genescanbeisolatedbytheconservationofexons當(dāng)然，如果染色體的全部序列被確定，鑒定一個(gè)獨(dú)特的基因就更加容易?？蓮娜旧w步行中獲得的連續(xù)系列克隆進(jìn)行測(cè)序，或者通過其他方式(比如直接比較序列)使克隆相聯(lián)系。若序列已知，基因可以通過比較其RNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物來確定，或者通過序列中的一個(gè)突變進(jìn)性鑒定。第一條可以用動(dòng)物印跡法（zooblot）來證明，首先我們從上述區(qū)域克隆出一小段序列作為探針（放射性標(biāo)記的）。利用Southernblotting的方法和別的物種的相關(guān)DNA雜交，這個(gè)探針常是人的DNA，若發(fā)現(xiàn)在許多物種中都存在與之雜交的片段，我們可以認(rèn)為它是基因的外顯子。這類確定的外顯子經(jīng)測(cè)序后，若證明它們含可譯框，就可被用來分離這個(gè)區(qū)域周圍的基因。若這些都顯示出是外顯子的一部分，則可以繼續(xù)鑒定整個(gè)基因，然后分離相應(yīng)的cDNA或mRNA，最后鑒定蛋白。上述方法對(duì)鑒定那些遺傳上暗示存在但其實(shí)質(zhì)未知的基因來說是寶貴的。一個(gè)例子是利用位于人Y染色體上的zfy基因作探針，與其它動(dòng)物的性染色體雜交的結(jié)果(圖2.17)，該探針能與哺乳動(dòng)物和其他種類的性染色體特異性雜交，含有開放讀框，用于鑒定一個(gè)保守基因。當(dāng)目標(biāo)基因含有很多大的外顯子且很長(zhǎng)時(shí)，Zooblot方法特別有用。Duchenne肌肉營(yíng)養(yǎng)不良(DMD，一種肌肉退化失調(diào)癥)基因鑒定，就是其中一例(圖2.18)DMD基因與X染色體連鎖，并影響1/3500男子出生。連鎖分析表明DMD位點(diǎn)位于X染色體Xp21條帶上?；糄MD疾病的病人通常在該條帶上產(chǎn)生DNA重排(Rearrangement)。通過比較X-連鎖DNA探針與患者DNA和正常人的雜交能力，可以獲得重排或患者體內(nèi)相關(guān)的克隆片段。染色體步移用來建立探針兩端的限制性圖譜，范圍可超過100kb的區(qū)域。通過對(duì)一系列患者中獲得的DNA分析，確定該區(qū)域有一很大缺失，并在兩個(gè)方向上延伸。最值得一提的是，缺失切除了一個(gè)對(duì)基因功能很重要的片段，并且該基因或至少基因的一部分包含在這個(gè)區(qū)域內(nèi)

Figure2.18ThegeneinvolvedinDuchennemusculardystrophyhasbeentrackeddownbychromosomemappingandwalkingtoaregioninwhichdeletionscanbeidentifiedwiththeoccurrenceofthedisease.2.6GenescanbeisolatedbytheconservationofexonsThisapproachisespeciallyimportantwhenthetargetgeneisspreadoutbecauseithasmanylargeintrons.ThisprovedtobethecasewithDuchennemusculardystrophy(DMD),adegenerativedisorderofmuscle,whichisX-linkedandaffects1in3500ofhumanmalebirths.ThestepsinidentifyingthegenearesummarizedinFigure2.10.基因在染色體上的大致區(qū)域確定后，我們需要鑒定它的內(nèi)含子和外顯子。采用zooblot方法確定了與小鼠X染色體和其他哺乳動(dòng)物DNA雜交的片段(圖2.19)，詳細(xì)檢查片段內(nèi)是否存在開放讀框和典型的內(nèi)含子-外顯子邊界序列。將符合這些標(biāo)準(zhǔn)的片段作為探針，進(jìn)一步在肌肉mRNA構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中檢測(cè)同源序列。Figure2.19

TheDuchenemusculardystrophygenehasbeencharacterizedbyzooblotting,cDNAhybridization,genomichybridization,andidentificationoftheprotein.

2.6Genescanbeisolatedbytheconservationofexons雜交篩選鑒定了一個(gè)與基因cDNA相關(guān)、非同尋常的大mRNA，約14kb。與基因組雜交表明，這個(gè)mRNA含60個(gè)以上得外顯子，2000kb的DNA，是目前已知DNA中鑒定為最長(zhǎng)的基因，其長(zhǎng)度是其他已知基因的10倍。這個(gè)基因編碼一個(gè)大約500kD的蛋白質(zhì)，稱為營(yíng)養(yǎng)不良蛋白質(zhì)(Dystrophin)，是肌肉的成分之一，但其含量甚微。所有DMD患者在這個(gè)位點(diǎn)上都有缺失或無效，并且影響營(yíng)養(yǎng)不良蛋白質(zhì)功能。另一種在遺傳片段上迅速找到外顯子的方法是外顯子捕獲(Exontrapping)技術(shù)(圖2.20)。該技術(shù)從一個(gè)攜帶強(qiáng)啟動(dòng)子，在兩個(gè)外顯子間僅有一個(gè)內(nèi)含子的載體開始。用這種載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大量含有兩個(gè)外顯子序列的RNA。內(nèi)含子上有一個(gè)限制性克隆位點(diǎn)，用來插入一段感興趣區(qū)域的片段。如果這個(gè)片段不包括外顯子，那么剪接模式不會(huì)改變，并且RNA僅包含親本載體一樣的序列。當(dāng)插入片段具有由兩部分內(nèi)含子包圍的外顯子時(shí)，其兩端的剪接點(diǎn)就會(huì)被識(shí)別，將外顯子序列插入到載體外顯子之間的RNA中。所獲得的RNA可通過逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用PCR擴(kuò)增載體兩個(gè)外顯子之間的序列進(jìn)行檢測(cè)。因此若能擴(kuò)增出來自目標(biāo)片段的序列，則表明外顯子被捕獲。由于動(dòng)物細(xì)胞中內(nèi)含子通常很大而外顯子很小，基因組DNA可能含有這種所需要的結(jié)構(gòu)，即一個(gè)外顯子兩端被部分內(nèi)含子包圍是有可能的。Chambon等分析比較了大量結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)含子切割位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)特點(diǎn)：①內(nèi)含子的兩個(gè)末端并不存在同源或互補(bǔ)序列。在剪切的初始階段，可能直接連接；②連接點(diǎn)具有很短的保守序列（圖13-20）也稱為邊界順序。100種內(nèi)含子的5′端都是GT；3′端都是AG，因此稱為GT-AG法則（GT-AGrule），又稱為Chambon法則。這兩個(gè)位點(diǎn)序列是不同的，左邊的剪接位點(diǎn)稱供體（donor）位點(diǎn)，右邊的剪接位點(diǎn)稱受體（acceptor）位點(diǎn)。這兩個(gè)位點(diǎn)對(duì)于剪接是十分重要的，一旦發(fā)生突變無論在體內(nèi)還是在體外，會(huì)抑制剪接。此法則幾乎適合于所有真核生物的核基因，這意味著它們切除內(nèi)含子的機(jī)制是相同的，但不適用于Ⅰ類內(nèi)含子。

Figure2.20

Aspecialsplicingvectorisusedforexontrapping.Ifanexonispresentinthegenomicfragment,itssequencewillberecoveredinthecytoplasmicRNA,butifthegenomicfragmentconsistssolelyofanintron,

2.6Genescanbeisolatedbytheconservationofexons外顯子捕獲P39(Exontrapping)2.8SomeDNAsequencescodeformorethanoneprotein有些DNA序列編碼多種蛋白質(zhì)Figure2.25

Twoproteinscanbegeneratedfromasinglegenebystarting(orterminating)expressionatdifferentpoints.

2.8SomeDNAsequencescodeformorethanoneprotein有些DNA序列編碼多種蛋白質(zhì)Figure2.26TwogenesmaysharethesamesequencebyreadingtheDNAindifferentframes.2.8SomeDNAsequencescodeformorethanoneproteinFigure2.27Alternativesplicingusesthesamepre-mRNAtogeneratemRNAsthathavedifferentcombin-ationsofexons.2.8SomeDNAsequencescodeformorethanoneproteinFigure2.28Alternativesplicinggeneratestheaandbvariantsoftroponin

Example:大鼠肌鈣蛋白(Troponin)T基因的3’端包括5個(gè)外顯子，但只有四個(gè)用于mRNA的構(gòu)建。雖然三個(gè)外顯子——WXZ表達(dá)模式一致，但上邊模式中α外顯子被剪接到XZ之間，而下邊模式中β外顯子被剪接到XZ之間。因此α型和β型肌鈣蛋白T在序列WZ之間的氨基酸序列不同，取決于α和β外顯子的替換模式。兩者中的任何一個(gè)都可以形成獨(dú)立的mRNA，但是二者不能同時(shí)用于一個(gè)mRNA中。Studiesonexpressedsequencesandproteincontentinhumancellssuggestedthatthereshouldbebetween100.000and150.000protein-codinggenes.However,resultsfromsequencingexperimentsshowedthatthehumangenomeonlycontainsaround30,000genesAlternativesplicing(交替\選擇\可變AS)Theremustbeawaytoregulateanddiversifythefunctionofgenesofdifferentiallyspecialisedcelltypes.Evolution’ssolutionforthegivenproblemisalternativesplicing(AS),whichisthemostimportantposttranscriptionalregulatorymechanismthatcausesproteomediversityandfunctionalcomplexity.AlternativesplicingmeansthatduringRNAsplicingdifferentcombinationsofexonsarejoinedtocreateadiversearrayofmRNAsfromasinglepre-mRNA.ResultingmaturemRNAsareeithernon-functionalormightgiverisetoproteinswithdifferentactivitiesandfunctions.Morethan70%-95%ofthehumanprotein-codinggenesarealternativelyspliced.Thisexplainsthefactthattherelativelysmallnumberof~30,000genescanleadtoaproteome(thetotalofallproteinsinacellororganism)ofseveralhundredthousandsofproteins.Anotherexampleisthefruitfly’s(Drosophilamelanogaster)genome(14,000genes)containingabout5,000geneslessthantheoneofasimpleprimalnematode(19,000genes).AnoutstandingexampleofanalternativelysplicedgeneisthesocalledDscamgeneofthefruitfly.Thisonegenecanbeprocessedintoabout38,000（38016）splicedvariants

2XofthetotalgenesinwholegenomeThestructureoftheDscamgeneinsixDrosophilaspp.ThematuremRNAofeachgenecontains22exons,fourofwhich(exon4,exon6,exon9andexon17,showningreen,blue,yellowandred,respectively)arechosenfromaclusterofalternativeexons.Theremaining18exons,showninmetallicgray,arealwaysselected.Intronsarenotshown.Redlinesindicateanexamplechoiceofexons.Useofalternativepromoters,poly-Asitesandterminalintronssplicing-processedontheir5’-and3’-ends(5’cappingand3’polyadenylation).ThesemodificationsarenecessaryfortheprotectionofmRNAsandalsoforregulationoftranslation.AlternativesplicingcausinganalterationatanyofthetwoRNAendscanthusleadtochangesinproteinproduction.Ontheotherhandchangesinthe5’regionofthenewtranscriptinfluencesIntronretentionThisiswhenanintronisnotremovedfromthemRNA.Thiscanleadtotheincorporationofaproteinsequenceorachangeinthereadingframe.cassettealternativeexonsThemostcommontypeofalternativesplicingevents(aroundonethird)involvescassettetypealternativeexons.InthiscaseanexoniseitherincludedorexcludedfromthemRNA.Splicingofacassetteexoncanresultinthecompleteinclusionorlossofaspecificfunctionalproteindomain.alternativesplicesites

Inthiscasealternative5’-or3’-splicesitesinexonorintronssequencesarechosenleadingtotheinclusionorexclusionofapartofanexonorintron.TheuseofanalternativesplicesitecanleadtosubtlechangesintheproteinactivityandthereforetoafinetuningoftheproteinfunctionMutualexclusionofexonsInthissplicingevent,eitheroneorotheroftwoexonsisincludedinthefinalmRNA–bothmutuallyexclusiveexonsarenotfoundtogetherinthemRNA.(e)alternativesplicesites(f)MutualexclusionofexonsGU-AG第一種類型為：盒式剪接。即發(fā)生可變剪接的時(shí)候會(huì)跳躍這個(gè)外顯子。如圖1.1第二種類型為:可變3’端剪接。即按照GU-AG規(guī)則，內(nèi)含子在發(fā)生切割的時(shí)候可以在下一個(gè)外顯子的上選擇不同的AG端：圖1.2第三種類型為:可變5’端剪接。即按照GT-AG規(guī)則，內(nèi)含子在發(fā)生切割的時(shí)候可以在上一個(gè)外顯子的上選擇不同的GT端：圖1.3第四種類型為:內(nèi)含子保留式剪接。即在發(fā)生連續(xù)的兩個(gè)外顯子拼接的時(shí)候中間的內(nèi)含子不被切除卻被保留下來。圖1.4第五種類型為:互斥性剪接。即圖中的綠色外顯子和紅色外顯子存在一種“有你沒有的關(guān)系，在任何情況下只能存在一個(gè)外顯子。圖1.5第六種類型為:可變5’末端。即這個(gè)基因的開始末端是可變的。圖1.6第七種類型為:可變的polyA末端剪接。即可以選擇不同的polyA末端作為這一轉(zhuǎn)錄本的結(jié)束。圖1.72.9Howdidinterruptedgenesevolve?現(xiàn)在割裂基因的原始形式是怎樣的呢?目前有兩種模型，“內(nèi)含子占先(Intronsearly)”模型支持內(nèi)含子總是基因的整體部分。認(rèn)為基因起始于割裂的結(jié)構(gòu)，沒有內(nèi)含子的基因是進(jìn)化過程中丟失的?！皟?nèi)含子滯后(Intronslate)”模型認(rèn)為原始蛋白質(zhì)編碼單位由非割裂的DNA序列組成，內(nèi)含子是隨后插入進(jìn)去的。這些模型的檢驗(yàn),明確真核和原核基因的區(qū)別，是否等同于真核基因中內(nèi)含子的獲得或者原核基因中內(nèi)含子的丟失。內(nèi)含子占先的結(jié)構(gòu)表明，基因的鑲嵌結(jié)構(gòu)是基因重組從而產(chǎn)生新蛋白質(zhì)的一種原始方法。試想，早期細(xì)胞有許多不同的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，其進(jìn)化的一個(gè)方面很可能是不同多肽鏈單位重新組合,拼接，從而產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)。如果蛋白質(zhì)編碼單位必須是連續(xù)的密碼子序列，重新創(chuàng)造這種序列將需要精確的DNA重組，從而使兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼單位并列，以同樣的讀碼框頭尾相接。并且，如果這種重組沒有成功，卻失去了原始的蛋白質(zhì)編碼單位，細(xì)胞必然受到破壞。但是如果DNA重組能將兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼單元置于一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位中，剪接模式將在RNA水平上獲得突破，從而將兩種蛋白質(zhì)放在一條多肽鏈中。而且如果重組并不成功，原始的蛋白質(zhì)編碼單位仍能被應(yīng)用。這種方法必然使細(xì)胞嘗試限制RNA刪除，而不至于在此過程中引起DNA穩(wěn)定性破壞。

exontrapping

illustratestheoutcomewhenarandomsequencethatincludesanexonist