基因工程載體(質(zhì)粒-3章)

基因工程載體概述基因工程是利用酶學(xué)方法將不同來(lái)源的DNA或cDNA，在體外切割、修飾、連接插入到不同目的的基因工程載體中，進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)，研究基因結(jié)構(gòu)和功能，基因和蛋白質(zhì)關(guān)系的一種分子生物學(xué)技術(shù)。載體基因工程的十分重要的工具。載體DNA分子中是有一段生長(zhǎng)擴(kuò)增的非必需區(qū)，該區(qū)經(jīng)人工改造后可插入外源的DNA，并可送入宿主細(xì)胞中，使外源DNA與載體DNA重組并共同擴(kuò)增。目前的載體主要有：

1,質(zhì)粒（Plasmid）載體

2,入噬菌體

3,柯斯質(zhì)粒（Cosmid）

4,M13噬菌體

5,雜交質(zhì)粒

6,病毒載體，包括穿梭載體（Shuttle）。

7,細(xì)菌人工染色體.(bacterialartificialchromosome，Shizuya，1992BAC)

8,酵母人工染色體(yeastartificialchromosome，Merry，1983YAC)

9,來(lái)源于P1的細(xì)菌人工染色體（P1-derivedartificialchromosomePAC,loannon，1994）、

10,哺乳動(dòng)物人工染色體（MAC，mamalartificialchromosome，F(xiàn)arr，1991）

11,人類(lèi)人工染色體（HAC，humanartificialchromosome，Harrington,1997）

12,植物人工染色體(PAC)

質(zhì)粒載體（Plasmid）

一詞最早是由Lederberg，1952年提出的。是雙鏈、閉環(huán)DNA復(fù)制子（replicon）,存在于細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中并獨(dú)立于染色體之外,能自主復(fù)制的一類(lèi)DNA。酵母的殺傷質(zhì)粒（KillerPlasmid）是例外,它是一種RNA復(fù)制子。根據(jù)導(dǎo)鏈霉菌中存在線狀質(zhì)粒

。質(zhì)粒是細(xì)菌復(fù)制所非必須的，也就是說(shuō)細(xì)菌失去質(zhì)粒后仍可正常生長(zhǎng)繁殖。但質(zhì)?？梢再x于寄主某種新的有利的表型。

質(zhì)粒載體

質(zhì)粒DNA的一般特點(diǎn)：

①質(zhì)粒DNA可在宿主菌中自主復(fù)制，又是細(xì)菌復(fù)制非必須的。

②占總的基因組的1～3%。

③所有原核生物都有質(zhì)粒。

④賦于細(xì)菌一種表型，是菌株特性不是菌種特性。

⑤隱蔽質(zhì)粒(Crypticplasmid)。⑥質(zhì)粒都是雙鏈閉環(huán)DNA復(fù)制子，酵母的殺傷質(zhì)粒例外(RNA)。質(zhì)粒的一般生物學(xué)性質(zhì)1969年Rownd提出嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒和松馳型控制的質(zhì)粒。主要指在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基生長(zhǎng)條件下，每個(gè)細(xì)菌中所含的質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)多少劃分的。嚴(yán)緊型質(zhì)粒，一般分子量較高；每個(gè)寄主細(xì)胞中僅含10~60個(gè)拷貝的質(zhì)粒；松馳型質(zhì)粒,每個(gè)細(xì)菌中所含的質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)高,一種質(zhì)粒究竟屬于嚴(yán)緊型還是松馳型并不是絕對(duì)的。往往與寄主狀況有關(guān)。質(zhì)粒的復(fù)制不僅受自身的制約，而且還受寄主菌的控制。氯霉素是蛋白質(zhì)合成的抑制劑，一般在細(xì)菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期(細(xì)菌達(dá)1×109細(xì)胞/mL)，加入氯霉素或壯觀霉素，細(xì)菌染色體和嚴(yán)緊型質(zhì)粒復(fù)制停止，而松馳型質(zhì)粒經(jīng)過(guò)10~12小時(shí)，每個(gè)細(xì)胞中可多達(dá)幾百個(gè)，甚至幾千個(gè)質(zhì)粒。每個(gè)細(xì)胞中可達(dá)50%以上DNA是質(zhì)粒DNA。嚴(yán)緊型(Stringentplasmid)和松馳型(relaxedplasmid)質(zhì)粒PUC質(zhì)粒都屬松馳型質(zhì)粒。PACYC184等質(zhì)粒屬嚴(yán)緊型質(zhì)粒。根據(jù)需要使用嚴(yán)緊型還是松馳型質(zhì)粒,如果插入外源DNA較大,或其產(chǎn)量過(guò)高會(huì)產(chǎn)生對(duì)宿主菌新陳代謝有干擾作用時(shí)，常選用嚴(yán)緊型質(zhì)粒。反之選用松馳型質(zhì)粒。2.質(zhì)粒的不相容性(incompatibility)

利用同一復(fù)制系統(tǒng)不同質(zhì)粒不能穩(wěn)定的和平共處的生存，稱為質(zhì)粒的不相容性，有時(shí)又稱不親和性，是指在沒(méi)有選擇壓力情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一寄主細(xì)胞中穩(wěn)定地共存現(xiàn)象。在細(xì)菌增殖過(guò)程中，其中一種質(zhì)粒必然會(huì)丟失。分子克隆技術(shù)正基于質(zhì)粒的不相容性質(zhì)，在只帶有一種質(zhì)粒的細(xì)菌中，提取單一的DNA。3.質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性細(xì)菌的質(zhì)粒分為接合型質(zhì)粒(Conjugativeplasmid)，又叫自我轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。它們既具有自我復(fù)制遺傳信息，又具有一套控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因。接合型質(zhì)粒多屬于嚴(yán)緊型質(zhì)粒。非接合型質(zhì)粒(non-conjugativeplasmid)也叫不能自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒。因?yàn)樗鼈儍H僅帶有自主復(fù)制的遺傳信息。非接合型質(zhì)粒多屬于松馳型質(zhì)粒。1）質(zhì)粒的類(lèi)型非接合型質(zhì)粒的寄主細(xì)胞中同時(shí)存在一種接合型質(zhì)粒，那么它們通常也是可以被轉(zhuǎn)移的。這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過(guò)程，叫質(zhì)粒的遷移作用（mobiligation）又叫質(zhì)粒的誘動(dòng)。

帶有大腸桿菌素基因的Col質(zhì)粒和帶有抗菌素抗性基因的R質(zhì)粒既有屬于接合型的，也有屬于非接合型的。如果在非接合型質(zhì)粒的寄主細(xì)胞中同時(shí)存在一種接合型質(zhì)粒，那么它們通常也是可以被轉(zhuǎn)移的。這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過(guò)程，叫質(zhì)粒的遷移作用(mobilization)又叫質(zhì)粒的誘動(dòng)。ColE1是一種可以遷移但屬于非接合型質(zhì)粒。2）F因子

F因子是最有代表性的接合型質(zhì)粒，又稱致育因子(fertilityfactor)或性質(zhì)粒(Sexplasmid)。它在寄主細(xì)胞中有三種存在方式：①獨(dú)立于染色體之外，閉環(huán)雙鏈DNA形式存在。這種細(xì)胞稱F+細(xì)胞。②獨(dú)立于染色體之外，閉環(huán)雙鏈DNA形式存在，但其DNA上還攜帶有寄主菌染色體基因或DNA區(qū)段。這種細(xì)胞稱之為F-細(xì)胞。③以線性DNA形式，從不同位點(diǎn)整合到寄主菌染色體上，這種細(xì)胞稱為Hfr細(xì)胞(高頻重組細(xì)胞)。F因子是雄性決定因子，F(xiàn)+細(xì)胞表面可以形成一種叫做性須（pilus）的結(jié)果，它促使F+經(jīng)性須進(jìn)入F-細(xì)胞。F-細(xì)胞則變?yōu)镕+細(xì)胞。F因子可以通過(guò)接合作用自我轉(zhuǎn)移，也能夠帶動(dòng)寄主染色體一道轉(zhuǎn)移。但F因子的這種整合過(guò)程是可逆的。在一定條件下，Hfr細(xì)胞又可重新變?yōu)镕+或F-細(xì)胞。基因工程多選用非接合型質(zhì)粒，主要安全角度考慮

人工質(zhì)粒要素1．質(zhì)粒的基因組小好（不影響生物學(xué)功能前題）。轉(zhuǎn)化入細(xì)菌的轉(zhuǎn)化率與質(zhì)粒大小呈反比，當(dāng)質(zhì)粒大于15kb時(shí)，轉(zhuǎn)化率將成為限制因素,質(zhì)粒大，拷貝數(shù)越低。2．質(zhì)粒應(yīng)易于轉(zhuǎn)化。3．質(zhì)粒應(yīng)有較多的拷貝數(shù)。4．選擇標(biāo)記。5．質(zhì)粒DNA可插入結(jié)合較大的外源DNA。

大腸桿菌質(zhì)粒分子的結(jié)構(gòu)示意圖環(huán)形染色體DNA環(huán)形質(zhì)粒分子大腸桿菌細(xì)胞抗菌素抗性基因控制質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移的基因質(zhì)粒DNA質(zhì)粒主要包括幾個(gè)組成部分復(fù)制子（reilcator）復(fù)制起始位點(diǎn)(replicationoriginsite)多克隆位點(diǎn)（Polylink）(MCS)輔助序列(COS位點(diǎn)等)選擇標(biāo)記(LacZ,抗性等)pUC18和pUC19質(zhì)粒圖譜質(zhì)粒主要包括幾個(gè)組成部分：一、復(fù)制子（reilcator）也就是基礎(chǔ)復(fù)制子（basicreplicon），具有原質(zhì)粒同樣拷貝數(shù)的最小自主復(fù)制單位。一般約2kb，含一個(gè)復(fù)制起始部位Orgin（Ori）拷貝數(shù)多少和攜帶有控制復(fù)制的基因信息。

復(fù)制起始位點(diǎn)(replicationoriginsite)

是富含A,T區(qū),雙鏈DNA在此解鏈出現(xiàn)復(fù)制叉.緊靠 富A,T區(qū)的側(cè)面富G,C區(qū),組成回文結(jié)構(gòu),是參與復(fù)制相關(guān)因子識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn).具備有多克隆位點(diǎn)（Polylink）(MCS)有數(shù)種限制性內(nèi)切酶單一識(shí)別位點(diǎn)。便于插入外源DNA片段，易組建重組質(zhì)粒而不影響質(zhì)粒復(fù)制功能

有多用途的輔助序列如加入不同啟動(dòng)子序列，用于生產(chǎn)單鏈DNA或RNA，外源基因的大量表達(dá)。又加入COS位點(diǎn)，使載體能容納更大的DNA片段等等。

質(zhì)粒載體的選擇標(biāo)記：外源DNA片段與質(zhì)粒載體DNA連接，再轉(zhuǎn)化入宿主菌，經(jīng)培養(yǎng)后需篩選鑒定轉(zhuǎn)化子。這就需要利用質(zhì)粒載體的可選擇標(biāo)記。

質(zhì)粒載體的選擇標(biāo)記

最常用，主要有：四環(huán)素(Tet)、氨芐青霉素(Amp)、氯霉素(Cm)、卡那霉素(Kan)、新霉素(Neo)等。如質(zhì)粒對(duì)氨芐青霉素有抗生時(shí)，則寫(xiě)成Ampr，反之則寫(xiě)成Amps。帶有抗藥性質(zhì)粒稱為R質(zhì)粒。一個(gè)質(zhì)粒載體通常有二種抗生素抗性基因，這樣篩選質(zhì)粒載體更可靠。外源DNA片段插入鈍化了一個(gè)抗性基因，保留了另一個(gè)抗性基因。插入失活型載體，就是將外源DNA片段插入到會(huì)導(dǎo)致選擇性基因(Ampr，Tetr等)失活的位點(diǎn)。如PACYC184質(zhì)粒的EcoRI上插入外源DNA片段，會(huì)導(dǎo)致氯霉素抗生基因失活(Cms)。也有例外，如Villa-Komaroff等1978年發(fā)現(xiàn)鼠胰島素cDNA片段插入PstI切點(diǎn)，并未使Ampr基因失活?？股乜剐曰蜻x擇標(biāo)記常用的是抗生素抗性基因的選擇標(biāo)記。主要有：四環(huán)素（Ter），氨芐青霉素（Amp），氯霉素（Cm），卡那霉素（Km）。新霉素（Neo）等。如質(zhì)粒對(duì)氨芐青霉素有抗生時(shí)，則寫(xiě)成AmPr，反之則寫(xiě)成AmPs，。帶有抗藥性質(zhì)粒稱為R質(zhì)粒。一個(gè)質(zhì)粒載體通常有二種抗生素抗性基因

新的質(zhì)粒還帶有下列標(biāo)記基因，使于篩選重組體：①HA②Luaferase③GFP④便于檢測(cè)的多肽原理是具有四環(huán)素抗性的細(xì)菌對(duì)親脂的螯合劑萎蔫酸(fusaricacid)極為敏感，因此，將外源性DNA插入到質(zhì)粒載體的四環(huán)素抗性基因的酶切位點(diǎn)上，在含有萎蔫酸的培養(yǎng)基上篩選對(duì)四環(huán)素敏感的重組子，則是十分方便的方法。丟失四環(huán)素抗性標(biāo)記的正選擇體系四環(huán)素抗菌機(jī)理是抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，使細(xì)菌停止生長(zhǎng)，但菌不死亡。環(huán)絲氨酸是氨基酸的類(lèi)似物，在細(xì)菌的生長(zhǎng)過(guò)程中，如加入環(huán)絲氨酸，則會(huì)參入到細(xì)菌