不同鹽度馴化對褐牙幼魚na

不同鹽度馴化對褐牙幼魚na

在相同的滲透條件下，魚類的消耗能量用于滲透和調節(jié)。在一些研究中，相同滲變量的能量占總能量代謝的20%-50%以上，在一些研究中，僅占10%。鹽度變化能引起魚類的鰓Na+-K+-ATP酶活力的改變,但由于不同種類的魚適應于生活環(huán)境,或同一種魚處于不同生活史階段,以及是否經過鹽度馴化等的差異,魚類鰓Na+-K+-ATP酶活力對鹽度變化表現(xiàn)出不同反應[7,8,9,10,11,12,13,14,15],沒有統(tǒng)一的變動模式。Na+-K+-ATP酶活力是鰓進行鈉、鉀離子主動運輸和滲透壓調節(jié)耗能的指標,因此鰓Na+-K+-ATP酶活力的變化可能與鹽度馴化期間能量代謝的改變有密切聯(lián)系,并引起魚類能量分配的變化,進而影響魚類適應環(huán)境的能力?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)魚類滲透調節(jié)的能量消耗占能量代謝的比例變動很大,而對鰓Na+-K+-ATP酶活力與魚類滲透調節(jié)期間的能量代謝的關系未見描述。在一些研究中發(fā)現(xiàn),養(yǎng)殖于較高鹽度的魚類身體脂肪含量隨鹽度的升高而下降,表明魚類的滲透壓調節(jié)活動可能引起能量代謝底物組成的改變。由于鹽度變化引發(fā)的滲透壓調節(jié)和能量代謝的變化對鹽度變化環(huán)境中魚類的生長和環(huán)境適應能力有重要影響,對魚類滲透調節(jié)指標和能量代謝指標進行研究可為探討魚類適應環(huán)境鹽度變動的機制提供資料。褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)是一種廣鹽性底棲魚類,在近岸水域和養(yǎng)殖環(huán)境中可能經歷鹽度的變動,并由此引發(fā)其滲透壓調節(jié)和能量代謝活動的變化。本實驗以褐牙鲆幼魚為研究對象,通過測定以不同鹽度日變幅馴化至低鹽和高鹽的馴化過程中以及在馴化后的適應過程中對其血清滲透壓、鰓Na+-K+-ATP酶活力、能量代謝的影響,分析褐牙鲆幼魚在鹽度馴化條件下的滲透調節(jié)機制及能量代謝與滲透壓調節(jié)的關系,為探討褐牙鲆滲透調節(jié)機制和適應鹽度變動環(huán)境的能力與策略提供參考,并為褐牙鲆增養(yǎng)殖過程中的鹽度馴化提供指導。1材料和方法1.1水土流失源暫養(yǎng)期間實驗用褐牙鲆幼魚購于山東省文登市小觀鎮(zhèn)養(yǎng)殖場,運回后置于實驗室水槽(280cm×175cm×150cm)中暫養(yǎng)2周。暫養(yǎng)期間,水溫(20.2±0.1)℃,鹽度33.0±0.3,pH=7.9±0.3,連續(xù)充氣,日換水率100%。每日06:00和18:00投喂升索牌鲆鰈類專用顆粒配合飼料,日投餌量為幼魚體重的3%～4%,投喂2h后及時吸除殘餌。1.2鹽度調節(jié)與能量代謝關系表1、2、4、8將體重(20±1.8)g的褐牙鲆幼魚由鹽度33分別以每天變化14、7、3.5的鹽度日變幅馴化至47和5,并在5和47鹽度下適應8d,測定馴化過程中鹽度在47、40、33、26、19、12、5時和適應第1、2、4、8天的耗氧率、排氨率、血清滲透壓、鰓絲Na+-K+-ATP酶活性,分析滲透壓調節(jié)與能量代謝的關系。鹽度調節(jié)方法為:低鹽度水體用經24h曝氣的自來水與天然海水(鹽度33)調配,高鹽度海水為天然海水加市售海水素調配并曝氣24h后使用。實驗水溫(20.2±0.1)℃。每一處理設10個重復(10尾)。1.3血清滲透率測定在每一鹽度下,將停食24h的褐牙鲆幼魚放入裝有對應鹽度的20L廣口玻璃瓶中適應2h,曝氣至溶氧飽和后,取水樣測定初始溶解氧和氨氮含量,然后用塑料膜將瓶密封,24h后打開重新取樣測定溶解氧和氨氮含量,保證實驗結束時水體溶氧含量大于4.0mg/L。取完水樣后用100mg/L的MS-222將魚麻醉,抽取血液,用于測定血清滲透壓。抽血后立即解剖魚體,取鰓測定鰓絲Na+-K+-ATP酶活力。鰓絲Na+-K+-ATP酶活力采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定,取實驗魚的鰓,用預冷的生理鹽水洗凈、濾紙吸干后稱重;制備2%組織勻漿液;4000r/min離心30min,取上清液。用定磷法測定Na+-K+-ATP酶活力(南京建成生物工程研究所ATP酶測試盒),蛋白質含量用考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定。以每小時每毫克蛋白分解ATP產生1μmol無機磷的量為一個ATP酶活力單位(μmolPi/mgprot·h)。滲透壓用露點滲透壓儀測定,用1mL注射器從實驗魚尾靜脈抽取血液,4℃下冰箱放置過夜后4600r/min離心10min,取血清,采用Vapro5520露點滲透壓儀測定血清滲透壓。溶解氧含量用碘量法測定,氨氮含量用次溴酸鈉氧化法測定。1.4呼吸瓶體積、排氨率計算耗氧率和排氨率的計算公式如下:耗氧率=(初始溶氧-結束溶氧)×呼吸瓶體積÷魚體重÷時間,排氨率=(結束氨氮含量-初始氨氮含量)×呼吸瓶體積÷魚體重÷時間。氧氮(原子數(shù))比計算方法如下:氧氮比=(耗氧率÷16)÷(排氨率÷14)。1.5dunpan多重比較對所有實驗數(shù)據(jù)進行了單因子方差分析,并對不同處理間的數(shù)據(jù)進行了DUNCAN多重比較,以P<0.05作為差異顯著的標準。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用SPSS11.0軟件包進行。2結果2.1兩組患者血清滲透率的變化在以日變幅3.5、7和14的鹽度馴化過程中,褐牙鲆幼魚血清滲透壓隨馴化鹽度提高或降低而上升或下降(見表1)。在馴化至高鹽度47的適應過程中,以鹽度日變幅7馴化的處理組血清滲透壓2d后顯著下降并趨于穩(wěn)定(P<0.05),而以鹽度日變幅14馴化的處理組血清滲透壓呈逐漸升高趨勢,第8天時升高顯著(P<0.05);在馴化至低鹽度5的適應過程中,以鹽度日變幅7馴化的處理組血清滲透壓2d后顯著下降并趨于穩(wěn)定(P<0.05),而以鹽度日變幅14馴化的處理組血清滲透壓在第2d時顯著下降(P<0.05),4d后趨于穩(wěn)定(見表2)。2.2對ws-pas酶活力的影響以鹽度日變幅3.5馴化至47的過程中,鰓絲Na+-K+-ATP酶活力均呈升高趨勢,以鹽度日變幅3.5馴化至5的過程中,鰓絲Na+-K+-ATP酶活力先上升后又下降至與對照處理無顯著差異水平;以鹽度日變幅7和14馴化至5和47的過程中,鰓絲Na+-K+-ATP酶活力無顯著變化(P>0.05)(見表3)。在馴化至高鹽度47的適應過程中,以鹽度日變幅7馴化的處理組Na+-K+-ATP酶活力2d后顯著上升并趨于穩(wěn)定(P<0.05),而以鹽度日變幅14馴化的處理組Na+-K+-ATP酶活力呈現(xiàn)上升后下降的趨勢,各時間段均無顯著差異(P>0.05);在馴化至低鹽度5的適應過程中,以鹽度日變幅7馴化的處理組Na+-K+-ATP酶活力第2d時顯著增加(P<0.05),之后略有下降并趨于穩(wěn)定,而以鹽度日變幅14馴化的處理組Na+-K+-ATP酶活力則呈先下降后回升再下降的趨勢,其變化水平顯著(P<0.05)(見表4)。2.3適應期間耗氧率的變化在馴化過程中,耗氧率以不同鹽度日變幅向47或5馴化過程中均呈現(xiàn)下降的總體趨勢(見表5)。以鹽度日變幅7馴化至47后適應期間耗氧率呈現(xiàn)先下降后回升的模式,而以鹽度日變幅14馴化至47后則呈現(xiàn)下降后穩(wěn)定的模式。以鹽度日變幅7馴化至5后的適應過程中耗氧率呈下降趨勢,而以鹽度日變幅14馴化至5后適應期間耗氧率在第4天明顯上升,到第8天又回落至與第1天沒有顯著差異的水平(見表6)。2.4向84馴化的期內階段在馴化過程中,排氨率以鹽度日變幅3.5向47馴化過程中無顯著變化,向低鹽度5馴化至26時顯著上升后下降至對照水平;以鹽度日變幅7向47馴化過程中明顯上升,向5馴化過程中均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;以鹽度日變幅14向5馴化過程中排氨率逐步升高(見表7)。以鹽度日變幅7馴化至47后適應期間排氨率呈現(xiàn)先下降后基本維持穩(wěn)定的模式,而以鹽度日變幅14馴化至47后適應期間排氨率較穩(wěn)定。以日變7馴化至5后適應期間排氨率只在第4天下降,以鹽度日變幅14馴化至5后適應期間排氨率呈現(xiàn)“上升—下降—上升”的變動模式(見表8)。2.3馴化過程氧氮比和鹽度變化在馴化過程中,氧氮比以鹽度日變幅3.5向47或5馴化過程中均呈現(xiàn)下降的總體趨勢;以鹽度日變幅7向47馴化過程中明顯下降,向5馴化過程中均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢;以鹽度日變幅14向5馴化過程中氧氮比逐步降低(見表9)。以鹽度日變幅7馴化至47后適應期間氧氮比不斷升高后穩(wěn)定,而以鹽度日變幅14馴化至47后則呈現(xiàn)先下降后上升再下降的模式。以鹽度日變幅7和14馴化至5后適應期間氧氮比呈現(xiàn)“下降—回升—下降”的模式(見表10)。3討論3.1鹽度對褐牙幼魚血漿滲透率、肝胰腺組織/高鹽等滲點的影響活性-一個波在不同鹽度日變幅的鹽度馴化過程中,褐牙鲆幼魚血清滲透壓隨馴化到的鹽度提高而上升,多種硬骨魚類在急性鹽度變化或鹽度馴化過程中的血清滲透壓變化規(guī)律與此相似,而有些魚類的血漿滲透壓不受鹽度變化的影響。Saoud等認為對于一些魚類而言,只有生活在極端的鹽度環(huán)境中時,其血漿滲透壓才會發(fā)生顯著變化。說明當周圍的鹽度發(fā)生變動時,魚類的血漿滲透壓變化具有種間特異性。本實驗中,以鹽度日變幅3.5由33馴化至47的過程中,鰓絲Na+-K+-ATP酶活力均呈升高趨勢,與血清滲透壓的變化趨勢一致,這說明以鹽度日變幅3.5的鹽度馴化能夠提高魚體對高鹽度馴化的主動調節(jié)能力。而以鹽度日變幅3.5由33馴化至5的過程中,鰓絲Na+-K+-ATP酶活力先上升后又下降至與對照處理無顯著差異水平,以鹽度日變幅7和14由33馴化至5和47的過程中,鰓絲Na+-K+-ATP酶活力無顯著變化,與血清滲透壓隨鹽度變化的趨勢不一致。淡水魚類莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)其鰓Na+-K+-ATP酶活力在淡水中最低,當將其移入高滲環(huán)境中時其Na+-K+-ATP酶活力會升高;海水魚類遮目魚(Chanoschanos)其鰓Na+-K+-ATP酶活力在海水中最低,當將其移入低滲環(huán)境中時其鰓Na+-K+-ATP酶活力會升高;河口(半咸水)魚類黑點河鲀(Tetraodonnigropunctatus)鰓Na+-K+-ATP酶活力在半咸水中最低,在低滲(淡水)或高滲(海水)環(huán)境中活力都會增加。本實驗結果與上述結果相似,表明硬骨魚類在鹽度適應的過程中,其鰓Na+-K+-ATP酶活力最低值通常出現(xiàn)在與其自然生活環(huán)境最相近的鹽度環(huán)境中,而不是出現(xiàn)在其等滲點的鹽度。血漿滲透壓調整期長短與魚類種類、鹽度變化強度、水溫、個體發(fā)育等有關,從數(shù)小時到數(shù)天不等,如點帶石斑魚(Epinephelusmalabaricus)為2h、軍曹魚(RachycentroncanadumL.)為2～3h左右、花狼魚(AnarhichasminorOlafsan)為12h左右、狼魚(Anarhichas.lupus)為1d,而褐牙鲆則為6d。本實驗研究結果顯示,以鹽度日變幅7馴化至47和5的適應過程中,褐牙鲆幼魚血清滲透壓達到穩(wěn)定的時間均為2d,以鹽度日變幅14馴化至5的適應過程中,達到穩(wěn)定的時間為4d,而以加上鹽度變化的時間來算,則均為6d,與潘魯青等直接將褐牙鲆放入鹽度18、12和6水體后血漿滲透壓穩(wěn)定時間相同。而以鹽度日變幅14馴化至47的適應過程中,在實驗期間內未檢測到穩(wěn)定時間,表明褐牙鲆幼魚適應高鹽度的能力較差,可能需要更長時間血清滲透壓才能達到穩(wěn)定。在鹽度馴化后的適應過程中,以鹽度日變幅7的高鹽和低鹽馴化處理組的褐牙鲆幼魚鰓絲Na+-K+-ATP酶活力在適應2d后顯著增加并趨于穩(wěn)定,這一時間與血清滲透壓達到穩(wěn)定的時間一致。而直接將褐牙鲆放入鹽度18、12和6水體后鰓絲Na+-K+-ATP酶活力達到穩(wěn)定則需要9d,比滲透壓達到穩(wěn)定的時間6d長。顯然本實驗鰓絲Na+-K+-ATP酶活力達到穩(wěn)定的總時間6d比其短,說明經高鹽和低鹽馴化后能使褐牙鲆幼魚及時的進行主動調節(jié),從而較快的適應鹽度變化。而以鹽度日變幅14的高鹽和低鹽馴化處理組的褐牙鲆幼魚鰓絲Na+-K+-ATP酶活力變化無明顯規(guī)律性,說明在鹽度馴化過程中,鹽度日變幅對褐牙鲆幼魚的鹽度適應能力具有重要影響。綜合考慮滲透壓和鰓絲Na+-K+-ATP酶活力趨于穩(wěn)定所需時間,作者認為采用鹽度日變幅為7.0對褐牙鲆幼魚進行鹽度馴化是較好的方案。3.2褐牙幼魚抗氧化酶系統(tǒng)中的指標變化本實驗發(fā)現(xiàn)褐牙鲆幼魚的耗氧率在鹽度日變幅為3.5和7.0的馴化過程中有明顯變化,鰓絲Na+-K+-ATP酶活力在鹽度日變幅為3.5的馴化過程中也有明顯變動,但未發(fā)現(xiàn)馴化過程中及馴化到高鹽度和低鹽度后適應階段褐牙鲆幼魚的耗氧率與鰓絲Na+-K+-ATP酶活力有明顯相關性,也未發(fā)現(xiàn)耗氧率與血清滲透壓變動趨勢有相似性,這表明在本實驗中鹽度馴化所引發(fā)的滲透壓調節(jié)指標與個體的日常能量代謝未表現(xiàn)出明顯關系。Swanson在對遮目魚的研究中發(fā)現(xiàn)滲透調節(jié)的能量代價與魚體和環(huán)境之間的滲透壓差距沒有直接關系,并估算滲透調節(jié)的能量消耗占日常代謝的7%左右。Potts等認為歐洲川鰈(Platichthysflesus)的滲透調節(jié)只占維持代謝的4%左右。由于滲透調節(jié)的能量消耗占個體能量代謝的比例較小,而且滲透調節(jié)參與的器官包括鰓、腎、腸道,因此鰓的滲透調節(jié)耗能占整個個體日常代謝耗能的比例太小,可能不足以引起個體耗氧率的明顯變化,所以本實驗也未發(fā)現(xiàn)褐牙鲆幼魚的耗氧率與鰓絲Na+-K+-ATP酶活力有明顯相關性。同時,雜色鳉(Cyprinodonvariegatus)和遮目魚在高鹽度水體中活動減弱,表明由于鹽度對魚類行為有明顯影響,使魚的能量代謝發(fā)生變化,由于這種影響的交互作用,也導致滲透調節(jié)的能量消耗與個體能量代謝比例不易定量。因此,本實驗中褐牙鲆幼魚的能量代謝與鰓絲Na+-K+-ATP酶活力未表現(xiàn)出明顯相關性,可能由于鰓的滲透調節(jié)耗能占整個個體日常代謝耗能很小的比例,而褐牙鲆幼魚在不同鹽度下的活動代謝變化掩蓋了鰓滲透調節(jié)引起的能量代謝變化。本實驗中褐牙鲆幼魚以不同鹽度日變幅到達不同鹽度24h內的耗氧率均基本以鹽度33為最高水平,最高鹽度47和最低鹽度5時耗氧率均降低。而大菱鲆(Scophamusmaximus)在鹽度由34向6和40突變的48h內耗氧率和排氨率均顯著上升,48h后恢復至對照水平。一方面可能是由于褐牙鲆相對于大菱鲆而言更為廣鹽性,并可能與雜色鳉和遮目魚類似,通過降低活動強度來減少能量支出,而大菱鲆則沒有類似的反應。另一方面由于本實驗是將褐牙鲆以不同日突變幅度馴化至高鹽度和低鹽度,可能也降低了應激活動的強度。褐牙鲆的主要能量代謝底物為蛋白質和脂肪,本實驗中褐牙鲆幼魚的氧氮比均超過20,表明能量代謝底物中脂肪和碳水化合物占有較大比例。本實驗未發(fā)現(xiàn)氧氮比變動與血清滲透壓及鰓絲Na+-K+-ATP酶活力變動趨勢有一致性,由于尚未發(fā)現(xiàn)有對它們之間的關系的報道,因此滲透壓調節(jié)指標與能量代謝底物之間的關系還有待進一步研究。在褐牙鲆和半滑舌鰨(Cynoglossussem