不同鹽度馴化對(duì)褐牙幼魚(yú)na

不同鹽度馴化對(duì)褐牙幼魚(yú)na

在相同的滲透條件下，魚(yú)類的消耗能量用于滲透和調(diào)節(jié)。在一些研究中，相同滲變量的能量占總能量代謝的20%-50%以上，在一些研究中，僅占10%。鹽度變化能引起魚(yú)類的鰓Na+-K+-ATP酶活力的改變,但由于不同種類的魚(yú)適應(yīng)于生活環(huán)境,或同一種魚(yú)處于不同生活史階段,以及是否經(jīng)過(guò)鹽度馴化等的差異,魚(yú)類鰓Na+-K+-ATP酶活力對(duì)鹽度變化表現(xiàn)出不同反應(yīng)[7,8,9,10,11,12,13,14,15],沒(méi)有統(tǒng)一的變動(dòng)模式。Na+-K+-ATP酶活力是鰓進(jìn)行鈉、鉀離子主動(dòng)運(yùn)輸和滲透壓調(diào)節(jié)耗能的指標(biāo),因此鰓Na+-K+-ATP酶活力的變化可能與鹽度馴化期間能量代謝的改變有密切聯(lián)系,并引起魚(yú)類能量分配的變化,進(jìn)而影響魚(yú)類適應(yīng)環(huán)境的能力?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)類滲透調(diào)節(jié)的能量消耗占能量代謝的比例變動(dòng)很大,而對(duì)鰓Na+-K+-ATP酶活力與魚(yú)類滲透調(diào)節(jié)期間的能量代謝的關(guān)系未見(jiàn)描述。在一些研究中發(fā)現(xiàn),養(yǎng)殖于較高鹽度的魚(yú)類身體脂肪含量隨鹽度的升高而下降,表明魚(yú)類的滲透壓調(diào)節(jié)活動(dòng)可能引起能量代謝底物組成的改變。由于鹽度變化引發(fā)的滲透壓調(diào)節(jié)和能量代謝的變化對(duì)鹽度變化環(huán)境中魚(yú)類的生長(zhǎng)和環(huán)境適應(yīng)能力有重要影響,對(duì)魚(yú)類滲透調(diào)節(jié)指標(biāo)和能量代謝指標(biāo)進(jìn)行研究可為探討魚(yú)類適應(yīng)環(huán)境鹽度變動(dòng)的機(jī)制提供資料。褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)是一種廣鹽性底棲魚(yú)類,在近岸水域和養(yǎng)殖環(huán)境中可能經(jīng)歷鹽度的變動(dòng),并由此引發(fā)其滲透壓調(diào)節(jié)和能量代謝活動(dòng)的變化。本實(shí)驗(yàn)以褐牙鲆幼魚(yú)為研究對(duì)象,通過(guò)測(cè)定以不同鹽度日變幅馴化至低鹽和高鹽的馴化過(guò)程中以及在馴化后的適應(yīng)過(guò)程中對(duì)其血清滲透壓、鰓Na+-K+-ATP酶活力、能量代謝的影響,分析褐牙鲆幼魚(yú)在鹽度馴化條件下的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制及能量代謝與滲透壓調(diào)節(jié)的關(guān)系,為探討褐牙鲆滲透調(diào)節(jié)機(jī)制和適應(yīng)鹽度變動(dòng)環(huán)境的能力與策略提供參考,并為褐牙鲆增養(yǎng)殖過(guò)程中的鹽度馴化提供指導(dǎo)。1材料和方法1.1水土流失源暫養(yǎng)期間實(shí)驗(yàn)用褐牙鲆幼魚(yú)購(gòu)于山東省文登市小觀鎮(zhèn)養(yǎng)殖場(chǎng),運(yùn)回后置于實(shí)驗(yàn)室水槽(280cm×175cm×150cm)中暫養(yǎng)2周。暫養(yǎng)期間,水溫(20.2±0.1)℃,鹽度33.0±0.3,pH=7.9±0.3,連續(xù)充氣,日換水率100%。每日06:00和18:00投喂升索牌鲆鰈類專用顆粒配合飼料,日投餌量為幼魚(yú)體重的3%～4%,投喂2h后及時(shí)吸除殘餌。1.2鹽度調(diào)節(jié)與能量代謝關(guān)系表1、2、4、8將體重(20±1.8)g的褐牙鲆幼魚(yú)由鹽度33分別以每天變化14、7、3.5的鹽度日變幅馴化至47和5,并在5和47鹽度下適應(yīng)8d,測(cè)定馴化過(guò)程中鹽度在47、40、33、26、19、12、5時(shí)和適應(yīng)第1、2、4、8天的耗氧率、排氨率、血清滲透壓、鰓絲Na+-K+-ATP酶活性,分析滲透壓調(diào)節(jié)與能量代謝的關(guān)系。鹽度調(diào)節(jié)方法為:低鹽度水體用經(jīng)24h曝氣的自來(lái)水與天然海水(鹽度33)調(diào)配,高鹽度海水為天然海水加市售海水素調(diào)配并曝氣24h后使用。實(shí)驗(yàn)水溫(20.2±0.1)℃。每一處理設(shè)10個(gè)重復(fù)(10尾)。1.3血清滲透率測(cè)定在每一鹽度下,將停食24h的褐牙鲆幼魚(yú)放入裝有對(duì)應(yīng)鹽度的20L廣口玻璃瓶中適應(yīng)2h,曝氣至溶氧飽和后,取水樣測(cè)定初始溶解氧和氨氮含量,然后用塑料膜將瓶密封,24h后打開(kāi)重新取樣測(cè)定溶解氧和氨氮含量,保證實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)水體溶氧含量大于4.0mg/L。取完水樣后用100mg/L的MS-222將魚(yú)麻醉,抽取血液,用于測(cè)定血清滲透壓。抽血后立即解剖魚(yú)體,取鰓測(cè)定鰓絲Na+-K+-ATP酶活力。鰓絲Na+-K+-ATP酶活力采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定,取實(shí)驗(yàn)魚(yú)的鰓,用預(yù)冷的生理鹽水洗凈、濾紙吸干后稱重;制備2%組織勻漿液;4000r/min離心30min,取上清液。用定磷法測(cè)定Na+-K+-ATP酶活力(南京建成生物工程研究所ATP酶測(cè)試盒),蛋白質(zhì)含量用考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定。以每小時(shí)每毫克蛋白分解ATP產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)ATP酶活力單位(μmolPi/mgprot·h)。滲透壓用露點(diǎn)滲透壓儀測(cè)定,用1mL注射器從實(shí)驗(yàn)魚(yú)尾靜脈抽取血液,4℃下冰箱放置過(guò)夜后4600r/min離心10min,取血清,采用Vapro5520露點(diǎn)滲透壓儀測(cè)定血清滲透壓。溶解氧含量用碘量法測(cè)定,氨氮含量用次溴酸鈉氧化法測(cè)定。1.4呼吸瓶體積、排氨率計(jì)算耗氧率和排氨率的計(jì)算公式如下:耗氧率=(初始溶氧-結(jié)束溶氧)×呼吸瓶體積÷魚(yú)體重÷時(shí)間,排氨率=(結(jié)束氨氮含量-初始氨氮含量)×呼吸瓶體積÷魚(yú)體重÷時(shí)間。氧氮(原子數(shù))比計(jì)算方法如下:氧氮比=(耗氧率÷16)÷(排氨率÷14)。1.5dunpan多重比較對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了單因子方差分析,并對(duì)不同處理間的數(shù)據(jù)進(jìn)行了DUNCAN多重比較,以P<0.05作為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS11.0軟件包進(jìn)行。2結(jié)果2.1兩組患者血清滲透率的變化在以日變幅3.5、7和14的鹽度馴化過(guò)程中,褐牙鲆幼魚(yú)血清滲透壓隨馴化鹽度提高或降低而上升或下降(見(jiàn)表1)。在馴化至高鹽度47的適應(yīng)過(guò)程中,以鹽度日變幅7馴化的處理組血清滲透壓2d后顯著下降并趨于穩(wěn)定(P<0.05),而以鹽度日變幅14馴化的處理組血清滲透壓呈逐漸升高趨勢(shì),第8天時(shí)升高顯著(P<0.05);在馴化至低鹽度5的適應(yīng)過(guò)程中,以鹽度日變幅7馴化的處理組血清滲透壓2d后顯著下降并趨于穩(wěn)定(P<0.05),而以鹽度日變幅14馴化的處理組血清滲透壓在第2d時(shí)顯著下降(P<0.05),4d后趨于穩(wěn)定(見(jiàn)表2)。2.2對(duì)ws-pas酶活力的影響以鹽度日變幅3.5馴化至47的過(guò)程中,鰓絲Na+-K+-ATP酶活力均呈升高趨勢(shì),以鹽度日變幅3.5馴化至5的過(guò)程中,鰓絲Na+-K+-ATP酶活力先上升后又下降至與對(duì)照處理無(wú)顯著差異水平;以鹽度日變幅7和14馴化至5和47的過(guò)程中,鰓絲Na+-K+-ATP酶活力無(wú)顯著變化(P>0.05)(見(jiàn)表3)。在馴化至高鹽度47的適應(yīng)過(guò)程中,以鹽度日變幅7馴化的處理組Na+-K+-ATP酶活力2d后顯著上升并趨于穩(wěn)定(P<0.05),而以鹽度日變幅14馴化的處理組Na+-K+-ATP酶活力呈現(xiàn)上升后下降的趨勢(shì),各時(shí)間段均無(wú)顯著差異(P>0.05);在馴化至低鹽度5的適應(yīng)過(guò)程中,以鹽度日變幅7馴化的處理組Na+-K+-ATP酶活力第2d時(shí)顯著增加(P<0.05),之后略有下降并趨于穩(wěn)定,而以鹽度日變幅14馴化的處理組Na+-K+-ATP酶活力則呈先下降后回升再下降的趨勢(shì),其變化水平顯著(P<0.05)(見(jiàn)表4)。2.3適應(yīng)期間耗氧率的變化在馴化過(guò)程中,耗氧率以不同鹽度日變幅向47或5馴化過(guò)程中均呈現(xiàn)下降的總體趨勢(shì)(見(jiàn)表5)。以鹽度日變幅7馴化至47后適應(yīng)期間耗氧率呈現(xiàn)先下降后回升的模式,而以鹽度日變幅14馴化至47后則呈現(xiàn)下降后穩(wěn)定的模式。以鹽度日變幅7馴化至5后的適應(yīng)過(guò)程中耗氧率呈下降趨勢(shì),而以鹽度日變幅14馴化至5后適應(yīng)期間耗氧率在第4天明顯上升,到第8天又回落至與第1天沒(méi)有顯著差異的水平(見(jiàn)表6)。2.4向84馴化的期內(nèi)階段在馴化過(guò)程中,排氨率以鹽度日變幅3.5向47馴化過(guò)程中無(wú)顯著變化,向低鹽度5馴化至26時(shí)顯著上升后下降至對(duì)照水平;以鹽度日變幅7向47馴化過(guò)程中明顯上升,向5馴化過(guò)程中均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì);以鹽度日變幅14向5馴化過(guò)程中排氨率逐步升高(見(jiàn)表7)。以鹽度日變幅7馴化至47后適應(yīng)期間排氨率呈現(xiàn)先下降后基本維持穩(wěn)定的模式,而以鹽度日變幅14馴化至47后適應(yīng)期間排氨率較穩(wěn)定。以日變7馴化至5后適應(yīng)期間排氨率只在第4天下降,以鹽度日變幅14馴化至5后適應(yīng)期間排氨率呈現(xiàn)“上升—下降—上升”的變動(dòng)模式(見(jiàn)表8)。2.3馴化過(guò)程氧氮比和鹽度變化在馴化過(guò)程中,氧氮比以鹽度日變幅3.5向47或5馴化過(guò)程中均呈現(xiàn)下降的總體趨勢(shì);以鹽度日變幅7向47馴化過(guò)程中明顯下降,向5馴化過(guò)程中均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì);以鹽度日變幅14向5馴化過(guò)程中氧氮比逐步降低(見(jiàn)表9)。以鹽度日變幅7馴化至47后適應(yīng)期間氧氮比不斷升高后穩(wěn)定,而以鹽度日變幅14馴化至47后則呈現(xiàn)先下降后上升再下降的模式。以鹽度日變幅7和14馴化至5后適應(yīng)期間氧氮比呈現(xiàn)“下降—回升—下降”的模式(見(jiàn)表10)。3討論3.1鹽度對(duì)褐牙幼魚(yú)血漿滲透率、肝胰腺組織/高鹽等滲點(diǎn)的影響活性-一個(gè)波在不同鹽度日變幅的鹽度馴化過(guò)程中,褐牙鲆幼魚(yú)血清滲透壓隨馴化到的鹽度提高而上升,多種硬骨魚(yú)類在急性鹽度變化或鹽度馴化過(guò)程中的血清滲透壓變化規(guī)律與此相似,而有些魚(yú)類的血漿滲透壓不受鹽度變化的影響。Saoud等認(rèn)為對(duì)于一些魚(yú)類而言,只有生活在極端的鹽度環(huán)境中時(shí),其血漿滲透壓才會(huì)發(fā)生顯著變化。說(shuō)明當(dāng)周?chē)柠}度發(fā)生變動(dòng)時(shí),魚(yú)類的血漿滲透壓變化具有種間特異性。本實(shí)驗(yàn)中,以鹽度日變幅3.5由33馴化至47的過(guò)程中,鰓絲Na+-K+-ATP酶活力均呈升高趨勢(shì),與血清滲透壓的變化趨勢(shì)一致,這說(shuō)明以鹽度日變幅3.5的鹽度馴化能夠提高魚(yú)體對(duì)高鹽度馴化的主動(dòng)調(diào)節(jié)能力。而以鹽度日變幅3.5由33馴化至5的過(guò)程中,鰓絲Na+-K+-ATP酶活力先上升后又下降至與對(duì)照處理無(wú)顯著差異水平,以鹽度日變幅7和14由33馴化至5和47的過(guò)程中,鰓絲Na+-K+-ATP酶活力無(wú)顯著變化,與血清滲透壓隨鹽度變化的趨勢(shì)不一致。淡水魚(yú)類莫桑比克羅非魚(yú)(Oreochromismossambicus)其鰓Na+-K+-ATP酶活力在淡水中最低,當(dāng)將其移入高滲環(huán)境中時(shí)其Na+-K+-ATP酶活力會(huì)升高;海水魚(yú)類遮目魚(yú)(Chanoschanos)其鰓Na+-K+-ATP酶活力在海水中最低,當(dāng)將其移入低滲環(huán)境中時(shí)其鰓Na+-K+-ATP酶活力會(huì)升高;河口(半咸水)魚(yú)類黑點(diǎn)河鲀(Tetraodonnigropunctatus)鰓Na+-K+-ATP酶活力在半咸水中最低,在低滲(淡水)或高滲(海水)環(huán)境中活力都會(huì)增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果相似,表明硬骨魚(yú)類在鹽度適應(yīng)的過(guò)程中,其鰓Na+-K+-ATP酶活力最低值通常出現(xiàn)在與其自然生活環(huán)境最相近的鹽度環(huán)境中,而不是出現(xiàn)在其等滲點(diǎn)的鹽度。血漿滲透壓調(diào)整期長(zhǎng)短與魚(yú)類種類、鹽度變化強(qiáng)度、水溫、個(gè)體發(fā)育等有關(guān),從數(shù)小時(shí)到數(shù)天不等,如點(diǎn)帶石斑魚(yú)(Epinephelusmalabaricus)為2h、軍曹魚(yú)(RachycentroncanadumL.)為2～3h左右、花狼魚(yú)(AnarhichasminorOlafsan)為12h左右、狼魚(yú)(Anarhichas.lupus)為1d,而褐牙鲆則為6d。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,以鹽度日變幅7馴化至47和5的適應(yīng)過(guò)程中,褐牙鲆幼魚(yú)血清滲透壓達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間均為2d,以鹽度日變幅14馴化至5的適應(yīng)過(guò)程中,達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間為4d,而以加上鹽度變化的時(shí)間來(lái)算,則均為6d,與潘魯青等直接將褐牙鲆放入鹽度18、12和6水體后血漿滲透壓穩(wěn)定時(shí)間相同。而以鹽度日變幅14馴化至47的適應(yīng)過(guò)程中,在實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)未檢測(cè)到穩(wěn)定時(shí)間,表明褐牙鲆幼魚(yú)適應(yīng)高鹽度的能力較差,可能需要更長(zhǎng)時(shí)間血清滲透壓才能達(dá)到穩(wěn)定。在鹽度馴化后的適應(yīng)過(guò)程中,以鹽度日變幅7的高鹽和低鹽馴化處理組的褐牙鲆幼魚(yú)鰓絲Na+-K+-ATP酶活力在適應(yīng)2d后顯著增加并趨于穩(wěn)定,這一時(shí)間與血清滲透壓達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間一致。而直接將褐牙鲆放入鹽度18、12和6水體后鰓絲Na+-K+-ATP酶活力達(dá)到穩(wěn)定則需要9d,比滲透壓達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間6d長(zhǎng)。顯然本實(shí)驗(yàn)鰓絲Na+-K+-ATP酶活力達(dá)到穩(wěn)定的總時(shí)間6d比其短,說(shuō)明經(jīng)高鹽和低鹽馴化后能使褐牙鲆幼魚(yú)及時(shí)的進(jìn)行主動(dòng)調(diào)節(jié),從而較快的適應(yīng)鹽度變化。而以鹽度日變幅14的高鹽和低鹽馴化處理組的褐牙鲆幼魚(yú)鰓絲Na+-K+-ATP酶活力變化無(wú)明顯規(guī)律性,說(shuō)明在鹽度馴化過(guò)程中,鹽度日變幅對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)的鹽度適應(yīng)能力具有重要影響。綜合考慮滲透壓和鰓絲Na+-K+-ATP酶活力趨于穩(wěn)定所需時(shí)間,作者認(rèn)為采用鹽度日變幅為7.0對(duì)褐牙鲆幼魚(yú)進(jìn)行鹽度馴化是較好的方案。3.2褐牙幼魚(yú)抗氧化酶系統(tǒng)中的指標(biāo)變化本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)褐牙鲆幼魚(yú)的耗氧率在鹽度日變幅為3.5和7.0的馴化過(guò)程中有明顯變化,鰓絲Na+-K+-ATP酶活力在鹽度日變幅為3.5的馴化過(guò)程中也有明顯變動(dòng),但未發(fā)現(xiàn)馴化過(guò)程中及馴化到高鹽度和低鹽度后適應(yīng)階段褐牙鲆幼魚(yú)的耗氧率與鰓絲Na+-K+-ATP酶活力有明顯相關(guān)性,也未發(fā)現(xiàn)耗氧率與血清滲透壓變動(dòng)趨勢(shì)有相似性,這表明在本實(shí)驗(yàn)中鹽度馴化所引發(fā)的滲透壓調(diào)節(jié)指標(biāo)與個(gè)體的日常能量代謝未表現(xiàn)出明顯關(guān)系。Swanson在對(duì)遮目魚(yú)的研究中發(fā)現(xiàn)滲透調(diào)節(jié)的能量代價(jià)與魚(yú)體和環(huán)境之間的滲透壓差距沒(méi)有直接關(guān)系,并估算滲透調(diào)節(jié)的能量消耗占日常代謝的7%左右。Potts等認(rèn)為歐洲川鰈(Platichthysflesus)的滲透調(diào)節(jié)只占維持代謝的4%左右。由于滲透調(diào)節(jié)的能量消耗占個(gè)體能量代謝的比例較小,而且滲透調(diào)節(jié)參與的器官包括鰓、腎、腸道,因此鰓的滲透調(diào)節(jié)耗能占整個(gè)個(gè)體日常代謝耗能的比例太小,可能不足以引起個(gè)體耗氧率的明顯變化,所以本實(shí)驗(yàn)也未發(fā)現(xiàn)褐牙鲆幼魚(yú)的耗氧率與鰓絲Na+-K+-ATP酶活力有明顯相關(guān)性。同時(shí),雜色鳉(Cyprinodonvariegatus)和遮目魚(yú)在高鹽度水體中活動(dòng)減弱,表明由于鹽度對(duì)魚(yú)類行為有明顯影響,使魚(yú)的能量代謝發(fā)生變化,由于這種影響的交互作用,也導(dǎo)致滲透調(diào)節(jié)的能量消耗與個(gè)體能量代謝比例不易定量。因此,本實(shí)驗(yàn)中褐牙鲆幼魚(yú)的能量代謝與鰓絲Na+-K+-ATP酶活力未表現(xiàn)出明顯相關(guān)性,可能由于鰓的滲透調(diào)節(jié)耗能占整個(gè)個(gè)體日常代謝耗能很小的比例,而褐牙鲆幼魚(yú)在不同鹽度下的活動(dòng)代謝變化掩蓋了鰓滲透調(diào)節(jié)引起的能量代謝變化。本實(shí)驗(yàn)中褐牙鲆幼魚(yú)以不同鹽度日變幅到達(dá)不同鹽度24h內(nèi)的耗氧率均基本以鹽度33為最高水平,最高鹽度47和最低鹽度5時(shí)耗氧率均降低。而大菱鲆(Scophamusmaximus)在鹽度由34向6和40突變的48h內(nèi)耗氧率和排氨率均顯著上升,48h后恢復(fù)至對(duì)照水平。一方面可能是由于褐牙鲆相對(duì)于大菱鲆而言更為廣鹽性,并可能與雜色鳉和遮目魚(yú)類似,通過(guò)降低活動(dòng)強(qiáng)度來(lái)減少能量支出,而大菱鲆則沒(méi)有類似的反應(yīng)。另一方面由于本實(shí)驗(yàn)是將褐牙鲆以不同日突變幅度馴化至高鹽度和低鹽度,可能也降低了應(yīng)激活動(dòng)的強(qiáng)度。褐牙鲆的主要能量代謝底物為蛋白質(zhì)和脂肪,本實(shí)驗(yàn)中褐牙鲆幼魚(yú)的氧氮比均超過(guò)20,表明能量代謝底物中脂肪和碳水化合物占有較大比例。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)氧氮比變動(dòng)與血清滲透壓及鰓絲Na+-K+-ATP酶活力變動(dòng)趨勢(shì)有一致性,由于尚未發(fā)現(xiàn)有對(duì)它們之間的關(guān)系的報(bào)道,因此滲透壓調(diào)節(jié)指標(biāo)與能量代謝底物之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。在褐牙鲆和半滑舌鰨(Cynoglossussem