酸奶的制備及革蘭氏染色技術

18200要生理功能的菌群，其廣泛存在于人體的腸道中。目前已被國內外生物學家所證明，腸內乳酸菌與安康長壽有著格外親熱的直接關系。中文學名乳酸菌 目： 乳桿菌目Lactobacillales界： 細菌界 乳桿菌科科：厚壁菌門 Lactobacillaceae門：Firmicutes 屬： 乳桿菌屬Lactobacillus綱： 芽孢桿菌綱Bacilli 代謝類型：乳酸菌是用蛋白液培育成的，在15--23度能快速的成長，并且分解蛋白，更有利于人體吸取凝固型酸乳的加工〔一〕原理利用乳酸菌在適當的條件下發(fā)酵產生乳酸，使乳的pH降低，導致乳凝固并形成酸味?！捕巢牧吓c方法材料穎乳或復原乳，保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌，脫脂乳培育基。儀器設備高壓均質機，高壓滅菌鍋，酸度計，酸性pH試紙，超凈工作臺，恒溫培育箱等。方法121℃，滅菌15min。菌種活化與培育用滅菌后的脫脂乳將粉狀菌種溶解，用接種環(huán)接種于裝有滅菌乳的三角瓶和試管中，42524h〔有助于風味物質的提高，再進展其次次、第三次接代培育，使保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌的滴定酸度分別達110°T90°T以上。1∶1的比例混4%423.5～4.0h。制備成母發(fā)酵劑，備用。工藝流程原料乳→加糖→預熱→均質→殺菌→冷卻→接種→裝瓶→培育→冷卻→成品。操作要點5%～7%的砂糖。53℃，20～25MPa下均質處理。9015min。424%。比例：桿菌：球菌=1∶1。423～4h?！踩迟|量評定可參照GB2746-1999進展感官指標味和其他外來的不良氣味。微生物指標大腸菌群數≤90個/100ml，不得有致病菌。3.理化指標脂肪〔扣除砂糖計算，全乳固體，酸度70～110T，砂糖≥5.0%，汞〔Hg計〕≤0.01×10-6。酸奶是乳酸菌和牛奶發(fā)孝的!酸牛奶是酸菌和牛奶發(fā)孝以后在加的水!工藝流程原料乳→凈乳→標準化→預熱(60℃)→均質 (150～250千克/厘米2)→殺菌→冷卻→添加發(fā)酵劑→分裝→發(fā)酵→冷藏(0～5℃)→檢驗→發(fā)送制作方法原料要求：用于制作發(fā)酵劑和生產酸乳的原料乳必需是高質量的，要求酸度在18°T以下，雜菌數不高于50萬個/毫升，總干物質含量不低11%，具有穎牛乳的味道和氣味，不得有外來異味，如飼料味、苦味、臭味和澀味等。不得使用乳腺炎乳。熱處理：牛奶通過90～95℃5有助于酸乳成品的穩(wěn)定性，防止乳清析出。接種與發(fā)酵：經預處理并冷卻至45℃左右的牛乳，泵送至可以保溫的緩沖罐中，同時將發(fā)酵劑按活力和比例用泵打入發(fā)酵罐中，與乳充分混合。將接種后的乳經灌裝后放入發(fā)酵室，培育溫度為42～45℃，時間為2～3小時，進展發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，對每個托盤上的發(fā)酵乳要認真觀看，必要時要取樣檢查，當 PH值到達4.5～4.7時，即可終止發(fā)酵，并馬上冷卻。冷卻：為了把握產品確實定酸度，發(fā)酵終了的冷卻格外重要。正常的冷卻速度是在發(fā)酵終了時，1～1.5小時內將溫度降至10～15℃以內。凝固型酸乳在動身酵室時必需留意輕拿輕放不得振動，否則破壞了蛋白質的凝乳構造而乳清析出。質量標準1.感官指標：色澤：色澤均勻全都，呈乳白色或稍帶微黃色。味道氣味：具有純乳酸發(fā)酵劑制成的酸牛乳特有的味道和氣味，無酒精發(fā)酵味、霉味和其它不良氣味。組織狀態(tài)：凝塊均勻細膩、無氣泡、允許少量乳清析出。2.理化指標：脂肪≥3.00%，全乳固體≥11.5%，酸度 70～110°T，砂糖≥5.0%，汞≤0.01%ppm。微生物指標：大腸菌群≤90個/毫升，致病菌不得檢出。革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。未經境形成鮮亮比照，可以清楚地觀看到細菌的形態(tài)、排列及某些構造特征，而用以分類鑒定。革蘭氏染色屬復染法。方法簡介是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，這種染色法是由一位丹麥醫(yī)生 漢斯·克里斯蒂安·革蘭〔HansChristianGram，1853年－1938年〕于1884年所制造，最初是用來鑒別肺炎球菌與克雷白氏肺炎菌之間的關系。未經染色之細菌，由于其與四周環(huán)境折光率差異甚小，故在顯微鏡下極難觀看陽性紫色陰性紅色。染色后細菌與環(huán)境形成鮮亮比照，可以清楚地觀看到細菌的形態(tài)、排列及某些構造特征，而用以分類鑒定。原理通過結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會消滅縫隙，，因此能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜快速溶解，薄而松散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。常見致病菌金黃色葡萄球菌、綠色溶血性鏈球菌、肺炎球菌、白喉桿菌、炭疽桿菌等 屬革蘭氏染色陽性菌。百日咳桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌、霍亂弧菌、流行性腦膜炎雙球菌、淋病雙球菌等屬革蘭氏陰性。所以依據細菌的革蘭氏染色性質，可以縮小鑒定范圍，有利于進一步分別鑒定，以對疾病做出診斷。又由于各種抗生素的抗菌譜不同，革蘭氏染色尚可做為選用抗生素的參考。試驗方法步驟革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：涂片固定。草酸銨結晶紫染1分鐘。自來水沖洗。加碘液掩蓋涂面染約1分鐘。水洗，用吸水紙吸去水分。加95%酒精數滴，并輕輕搖動進展脫色，20秒后水洗，吸去水分。蕃紅梁色液〔稀〕染2分鐘后，自來水沖洗。枯燥，鏡檢。原理通過結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會消滅縫其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜快速溶解，薄而松散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。染色結果革蘭氏正反響菌體都呈紫色，負反響菌體都呈紅色。臨床意義其重要的臨床意義在于：1.鑒別細菌2.選擇藥物3.與致病性有關：：革蘭氏陽性菌能產生外毒素，革蘭氏陰性菌能產生內毒素，兩者的致病作用不同。特性染色后細菌與環(huán)境形成鮮亮比照，可以清楚地觀看到細菌的形態(tài)、排列及某些結構特征，而用以分類鑒定。革蘭氏染色屬復染法，馬上標本固定后，先用龍膽紫染色，加碘液媒染后用酒精脫色，再用蕃紅復染。染色后除可以看到細菌形態(tài)外，還可將細菌分為兩大類，即不被酒精脫色而保存紫色者為 革蘭氏陽性菌〔G+。被酒精脫色染成紅色者為革蘭氏陰性菌〔G-。革蘭氏染色原理尚不愿定，可能與細菌所帶核糖核酸、細菌壁構造通透性、等電點等因素有關。致病菌如金黃色葡萄球菌、綠色溶血性鏈球菌、肺炎球菌、白喉桿菌、碳疽桿菌等屬革蘭氏染色陽性菌。百日咳桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌、霍亂弧菌、流行性腦膜炎雙球菌、淋病雙球菌等均屬革蘭氏陰性。所以依據細菌的革蘭氏染色性質，可以縮小鑒定范圍，有利于進一步分別鑒定，以對疾病做出診斷。又由于各種抗生素的抗菌譜不同，革蘭氏染色尚可做為選用抗生素的參考。鑒定原理革蘭氏染色該染色法所以能將細菌分為G+菌和G-菌，是由這兩類菌的細胞壁構造和成分的不同所打算的。G-菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質，增加了細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細菌就被脫色，再經蕃紅復染后就成紅色。 G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質含量少，經脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保存初染時的顏色，呈現(xiàn)藍紫色。試驗流程1、取載玻片用紗布擦干，載玻片的一面用 marker 筆畫一個小圈〔用來大致確定菌液滴的位置〕。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。2、涂片：液體培育基：左手持菌液試管，在酒精燈火焰四周 5cm左右翻開管蓋；右手持接種環(huán)在火焰中燒灼滅菌，等冷卻后從試管中沾取菌液一環(huán)，在干凈無脂的載玻片上涂直徑2mm左右的涂膜，最終將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。固體培育基：先在載玻片上滴一滴無菌水，再用接種環(huán)取少量菌體，涂在載玻片上，使其薄而均勻。3、晾干：讓涂片在空氣中自然枯燥。4、固定：讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定〔以不燙手為宜〕5、染色：將固定過的涂片放報紙上，滴加草酸銨結晶紫液，染 1min。6、水洗：用水緩慢沖洗涂片上的染色液，用吸水紙吸干。簡潔染色完畢可觀看細胞形態(tài)。7、媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。8、脫色：吸去殘留水，連續(xù)滴加 95%乙醇脫色20-30s至流出液無紫色，馬上水洗。9、復染：滴加蕃紅復染3-5min，水洗。至此，革蘭氏染色完畢?？赡苷`差在試驗中常常會消滅假陽性和假陰性的結果，假陽性主要是由于脫色不完全，可在試驗中常常會消滅假陽性和假陰性的結果，假陽性主要是由于脫色不完全，可能是由于涂片過厚，或者是結晶紫染色過度，導致脫色不完全。假陰性可能是由于細胞固定過度，造成細胞壁通透性的轉變，而消滅假陰性結果；另外，細胞培育時間太長，可能已經有局部細胞發(fā)生死亡或者自溶，也導致細胞壁通透性的轉變而消滅假陰性結果。簡介乳酸桿菌是指能使糖類發(fā)酵產生乳酸的細菌,酸牛奶中有此菌。原理分別篩選微生物菌種的根本程序乳桿菌屬乳酸桿菌科，因發(fā)酵糖產生大量乳酸而命名。存在廣泛。嗜酸性，最適ph5.5～6.0,ph3.0～4.5仍能生存，在無芽胞桿菌中其耐酸力最強。腸道乳酸桿菌可分解糖產酸，抑制致病菌及腐敗菌的生殖， 乳酶生即由活的乳酸桿菌制成，可治療消化及腹瀉。酸牛奶中的乳酸桿菌也有抑制腸道致病菌的作用。齲齒活動狀態(tài)與唾液乳酸液桿菌計數之間有明確的相互關系。分別篩選微生物菌種的根本程序流程優(yōu)良糖化酶菌株的分別與篩選溶化培育基→倒平板→打散孢子團?！荻认♂尅坎计桨濉嘤^看→滴加碘液→挑菌落→接種→培育→糖化酶活力測定→菌種保存酸乳制品中的乳酸菌的分別制培育基→倒平板→梯度稀釋→涂布平板→培育觀看→挑菌落→接牛乳管→培育觀看→傳代培育→選擇凝乳管→乳酸測定→菌種保存步驟優(yōu)良糖化酶菌株的分別與篩選溶化淀粉察氏培育基，稍冷后倒平板與斜面數個。取種曲少許，參與10mL帶玻璃球的無菌生理鹽水的三角瓶中，用力振蕩打散孢子團粒，使之形成均勻的孢子懸浮粒。然后將其用無菌紗布過濾于無菌試管中。1010-730.2mL，于淀粉察氏培育基平板上用無菌涂布器分別依次涂布23個皿，301~2d。〔5〕性能測定：測定各菌落的糖化酶活力。酸乳制品中的乳酸菌的分別制備BCG牛乳養(yǎng)分瓊脂培育基。10g50mL1.6%0.07mL，0.075MPa壓力下滅菌20min。2g，溶于50mL水中，加酵母膏1g，溶解后調pH6.8，0.1MPa壓力下滅20min。③趁熱將上述兩液以無菌操作混合均勻，倒平板6個，待凝固后，置37℃培育24h，假設無雜菌生長，即可使用。1010-710-7、10-62個稀釋度的稀釋液各0.1~0.2mL，分別置于上述各養(yǎng)分平板上，用無菌涂布器依次涂布2343℃培育48h，如消滅圓形稍扁平的黃色菌落及其四周培育基亦為黃色者初步定為乳酸菌。將典型菌落轉至脫脂乳發(fā)酵管，43℃培育8~24h，假設牛乳管凝固，無氣泡，呈酸性，鏡檢細胞桿狀或鏈球狀，革蘭氏染色呈陽性，則將其連續(xù)傳代假設干次，43℃培育，選擇出3~4h能凝固的乳管，保存?zhèn)溆?。乳酸菌的鑒定及生物量的測定。乳酸菌的鑒定方法形態(tài)和培育特征觀看承受牛肉膏蛋白胨培育基,將已純化后的甘油菌種活化后于37℃下培育20～24h,并進展革蘭氏染色及菌體形態(tài)和菌落特征的觀看。染色方法參照微生物鑒定試驗指導生長條件試驗(1)耐鹽性試驗(NaCl濃度:0.85、1.201.71)(mol/L);(2)耐酸堿試驗(pH:4.3、5.7、6.8、8.4、8.68.7);(3)溫度梯度試驗(溫度:10℃、30℃、40℃、50℃、55℃、6065℃)。分別將參試菌接種于以上處理的液體培育基中培育48h,記錄生長狀況。生理生化試驗⑴過氧化氫酶測定將試驗菌接種于PGY培育基斜面上,37℃培育20h—24h,取一環(huán)接種的培育物,涂于干凈的載玻片上,然后在其上滴加3%－—15%的過氧化氫,有氣泡則為陽性反響,無氣泡為陰性反響。⑵葡萄糖產酸產氣試驗PY30g5%吐溫-80,1.6g/100mL1.4mL作指示劑,在培育基內放置一小倒管,分裝試管置3724h,經培育后,指示劑變黃表示產酸,倒管內消滅氣泡,表示產氣。⑶淀粉水解試驗接種穎的菌種于含有0.5g可溶性淀粉的PY根底培育基中,取少許培育液于比色盤內,同時取未接種的培育液作比照,分別在其中參與盧哥氏碘液.不顯色表示淀粉水解,顯藍黑色或藍紫色時,表示淀粉未水解或水解不完全。⑷明膠液化試驗將試驗菌接種于明膠根底培育基中,置37℃培育,未接種的比照管置于冰箱或冷水中,等待比照管凝固后記錄試驗結果,反復觀看比照屢次。如比照管凝固時,接種管液化為陽性反響,凝固為陰性反響⑸甲基紅〔M.R〕試驗接種試驗細菌于PYG372天后，于培育物中參與幾滴甲基紅酒精溶液，如呈紅色，表示陽性。⑹乙酰甲基甲醇V-P試驗接種穎的試驗菌種于培育基中,372天后,1mL在其中1ml10％的NaOH3－42%氯化鐵溶液。數小時后，培育基外表的下層消滅紅色者，為陽性⑺檸檬酸鹽取幼齡菌種接種于檸檬酸鹽斜面培育基上，適溫培育3－7天，培育基呈堿性〔藍色〕者為陽性反響，不變者則為陰性⑻酪素水解試驗牛奶平板的制備：取5g50mL蒸餾水中〔或用50mL脫脂牛奶〕，另稱1.5g瓊脂溶于50mL蒸餾水中，將兩液分開滅菌。待冷至45－50℃時，將兩液混勻倒平板，即3－5株菌。適溫培育1、3、5天，記錄菌落四周和下面酪素是否已被分解而呈透亮。配制該培育基時，切勿將牛奶和瓊脂混合滅菌，以防牛奶凝固⑼厭氧生長測定將菌種接入養(yǎng)分肉湯平板后,用密封帶包好放入CO2372天后,觀看生長狀況,生長則為陽性厭氧硝酸鹽產氣接種封油：以斜面菌種用接種環(huán)接種后，用凡士林油〔凡士林和液體石蠟為1:1〕封管，封1厘米。必需同時接種不含有硝酸鉀的肉汁胨培育液作比照。2－7d能按可疑或陰性處理。石蕊牛奶的反響其產酸、產堿、胨化、酸凝固、凝乳酶凝固、復原狀況糖發(fā)酵試驗將需要測定的糖或醇類等碳水化合物參與PY根底培育基中,按表分裝含5mL培育基的試管.分別取0.2mL,被鑒定菌株接到滅菌后的碳水化合物培育基中37℃培育24h,時取培育液少許置于比色盤內,同時取未加碳水化合物的PY培育液作為比照,滴加試劑比較顏色的變化,記錄產酸的強弱.附一些培育基：①PY培育基〔100mL〕：蛋白胨1.0g,酵母提取物1.0g,無機鹽溶液4.0mL[鹽溶液成分:無水CaCl2 0.2g,MgSO4 20.0g,K2HPO4 1.0g,,KH2PO4 1.0g,NaHCO310.0g,NaCl2.0g](將CaCl2和MgSO4300mL蒸餾水中,500mL蒸餾水,一邊攪拌一邊緩慢參與其他鹽類.連續(xù)攪拌直到全部溶解,1000mL,4℃)②PYG培育基:PY1.0g葡萄糖5g3g、明膠120g、蒸餾水1000mL、pH6.8～7.0；加熱溶解、校正至pH7.4～7.6，分裝小管，12110min，取出后快速冷卻，使其凝固。復查pH6.8～7.0④檸檬酸鹽斜面培育基：檸檬酸鈉3g NH4H2PO41g MgSO4 0.2gK2HPO41g NaCl5g 15—20g1000mLpH71.6%10mL,5mL，12130min2g硝酸鉀入養(yǎng)分肉湯4.16SrD