免疫學實驗課件

免疫學實驗課件免疫學實驗室中性粒細胞的吞噬作用【實驗目的】1.熟悉中性粒細胞吞噬實驗的原理和方法。2.通過本實驗理解機體的非特異性免疫機制?！緦嶒炘怼恐行粤＜毎哂型淌蓺⒕δ?，當與顆粒性物質（如葡萄球菌等）混合孵育一定時間后，顆粒性物質被吞噬殺滅，根據吞噬率、吞噬指數可反映該細胞的吞噬功能。【實驗材料】1.表皮（白色）葡萄球菌菌液（濃度6~10億/ml)。2.肝素溶液（25U/ml）；甲醇，堿性美藍（或瑞氏）染液。3.血紅蛋白吸管，凹玻片，載玻片，采血針，微量加樣器，濕盒，顯微鏡，恒溫培養(yǎng)箱，75%酒精，棉簽，香柏油，二甲苯等?！緦嶒灧椒ā?、用微量加樣器，吸取肝素20ul加入潔凈凹玻片凹孔內。2、用酒精棉簽消毒手指后，刺破皮膚，以血紅蛋白吸管取血40ul，立即放入盛有肝素的凹玻片凹孔內，并充分混勻。3、用微量加樣器取葡萄球菌菌液20ul加入上述凹玻片凹孔內，充分混勻。4、將凹玻片置于濕盒內，30℃溫箱中30min，其間每隔10min搖勻一次。5、取一小滴上述混合液，置于載玻片上，用另一載玻片推成薄血片，待干。6、滴加甲醇固定3min，水洗。7、加堿性美藍染色1~2min，水洗，印干。8、置油鏡下觀察吞噬和未吞噬的白細胞并計數?！緦嶒灲Y果】

【實驗思考】1、在吞噬細胞中發(fā)現(xiàn)細菌時，如何區(qū)別吞噬的細菌和粘附在吞噬細胞表面的細菌？2、簡述機體非特異性免疫的概念及特點。凝集反應【實驗目的】1．了解凝集反應的原理、基本類型及其臨床意義。2．掌握玻片凝集實驗、間接凝集實驗的實驗方法和結果分析?！靖攀觥?/p>

在一定濃度的電解質溶液中，顆粒性抗原與相應抗體結合后，出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，稱為凝集反應。凝集反應是一種定性的檢測方法，也可以進行半定量檢測。凝集反應可分為直接凝集反應和間接凝集反應。由于凝集反應方法簡便，目前在臨床檢驗中仍被廣泛應用。

一、直接凝集反應細菌、細胞等顆粒性抗原，在適當電解質參與下可直接與相應抗體結合出現(xiàn)凝集，稱為直接凝集反應。常用的凝集試驗有玻片法和試管法兩種。玻片凝集試驗——ABO血型鑒定玻片凝集試驗為定性試驗，一般用已知抗體作為診斷血清，與受檢顆?？乖?，如菌液或紅細胞抗原各加一滴在玻片上，混勻，數分鐘后即可用肉眼觀察凝集結果，出現(xiàn)凝集顆粒的為陽性。此法簡便，快速，適用于從病人標本中分離得到的菌種的診斷或分型，也可用于紅細胞ABO血型的鑒定。

【實驗原理】人類ABO血型抗原主要有A和B兩種，根據紅細胞表面這兩種抗原的有無可把血型分為四種。據此，將抗A和抗B抗體分別與待測紅細胞混合，抗A或（和）抗B抗體與紅細胞表面上的相應抗原結合而引起紅細胞凝集，據其凝集情況便可判定出受試者的血型。ABO血型的劃分

紅細胞表面Ag血清中AbA型A抗BB型B抗AAB型A、B—、—O型—、—抗A、抗B【實驗材料】1．ABO血型鑒定試劑盒內含抗A分型試劑和抗B分型試劑各1支。2．一次性采血針1枚、潔凈玻片2塊、75％酒精、滅菌棉簽。3．84消毒液3．用酒精棉簽消毒被檢者手指尖端，以采血針刺破皮膚，稍加擠壓，使血液流出。用另一載玻片一端取適量血液加入抗抗A分型試劑，并混勻；用另一端再取適量血液加入抗抗B分型試劑，并混勻。用干棉簽止血。4．觀察紅細胞有無凝集發(fā)生。如有凝集，可見紅細胞凝集成塊；無凝集，紅細胞呈均勻分散。判定結果后把玻片放入消毒液中。AB【實驗方法】1．取潔凈載玻片1塊，并標記（如圖）2．將抗A、B分型試劑分別加1滴于標記有A、B的玻片兩側?？笰抗B抗A分型試劑側抗B分型試劑側血型+—A—+B++AB——O“＋”表示紅細胞凝集，“－”表示紅細胞未凝集【實驗結果】記錄受檢者紅細胞凝集情況，根據ABO血型鑒定表(下表)，判斷受檢者的血型。

ABO血型鑒定表二、間接凝集反應

將可溶性抗原或抗體先吸附于適當大小的顆粒性載體表面（這種載體與免疫無關），然后與相應抗體或抗原結合，在適量的電解質存在下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反應。根據載體的不同可將間接凝集反應分為：間接血細胞凝集試驗、間接乳膠凝集試驗（及間接乳膠凝集抑制試驗）和金黃色葡萄球菌協(xié)同凝集試驗等。間接凝集抑制試驗——妊娠試驗【實驗原理】可溶性抗原致敏的乳膠顆粒與相應抗體作用可使乳膠顆粒凝集，此為間接乳膠凝集試驗。若使抗體先與可溶性抗原作用，再加入該抗原致敏的乳膠顆粒，則乳膠凝集被抑制，此為間接乳膠凝集抑制試驗。孕婦尿中絨毛膜促性腺激素（HCG）含量明顯增高。HCG與抗HCG抗體先作用后，再加入HCG致敏的乳膠顆粒，不出現(xiàn)凝集反應，此為妊娠試驗陽性；非孕婦尿中HCG含量不足以消耗掉抗HCG抗體，抗體與后加入的HCG致敏乳膠結合呈現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則妊娠試驗陰性。【實驗材料】1．妊娠診斷試劑盒：內含抗血清（抗HCG）、乳膠抗原（HCG致敏）各一支2．待檢尿、孕婦尿、正常尿。3．有格玻片和毛細吸管等。【實驗方法】1．在玻片的第1、第2和第3格內分別加1滴正常尿、待檢尿及孕婦尿。2．每格內加入妊娠診斷試劑抗血清1滴。輕輕搖動1~2min使其充分混勻。3．每格加入乳膠抗原1滴，輕輕搖動玻片3~5min后觀察結果，記錄各標本有無凝集現(xiàn)象。

【實驗結果】孕婦尿格呈均勻渾濁乳狀液，無凝集，妊娠試驗陽性；正常尿格出現(xiàn)白色細小凝集物，隨時間延長凝集物變成小塊狀，妊娠試驗陰性。待檢尿若為乳狀液，妊娠試驗陽性；若出現(xiàn)凝集，則妊娠試驗陰性?！咀⒁馐马棥?．試驗所用診斷試劑用前應充分搖勻，而且應在有效期內使用。2．加樣用的滴管及混勻用的牙簽不能共用。3．加樣不宜太多，玻片應始終保持水平，以防兩格之反應液相混?！緦嶒炈伎肌?．記錄血型鑒定試驗、乳膠妊娠診斷試驗的材料、方法及結果判定（可用圖示或表格方式表示）。2．直接凝集試驗與間接凝集試驗有何不同？3．在各凝集試驗中都設有相應對照，有何意義？若對照出現(xiàn)異常如何分析及解決？

沉淀反應

【實驗目的】1．掌握對流免疫電泳的基本原理、方法。2．熟悉瓊脂單向擴散，雙向擴散的基本原理、方法、結果分析及臨床用途。3．了解火箭免疫電泳的基本原理、方法?！靖攀觥靠扇苄钥乖缪?、毒素、細菌浸出液等與相應抗體結合，當兩者比例合適、并有適量電解質存在時，形成肉眼可見的沉淀物或沉淀線，稱為沉淀反應。沉淀反應是臨床上最常用、最基本的方法之一。它的種類較多，可分為瓊脂擴散試驗、免疫電泳試驗、環(huán)狀沉淀試驗及絮狀沉淀試驗等。一、瓊脂擴散試驗利用可溶性抗原與相應抗體在半固體瓊脂內進行擴散，當兩者比例合適時，就出現(xiàn)白色沉淀線，為陽性反應。本試驗可在試管內、平皿中以及玻片上的瓊脂內進行操作。瓊脂擴散試驗可分為單向瓊脂擴散試驗和雙向瓊脂擴散試驗。(一)單向瓊脂擴散試驗(示教)(二)雙向瓊脂擴散實驗(示教)二、對流免疫電泳【實驗原理】帶電的膠體顆?？稍陔妶鲋幸苿?，移動方向與膠體顆粒所帶電荷有關。多數蛋白質抗原在堿性緩沖液中帶負電荷，在電泳時從負極向正極移動?？贵w屬球蛋白，在堿性緩沖液只帶微弱的負電荷，而且相對分子質量較大，電泳力較小，在瓊脂電滲力作用下反而由正極向負極移動。這樣就使抗原和抗體定向對流，在兩孔間相遇時發(fā)生反應，并在比例合適處形成肉眼可見的白色沉淀線。這種將雙向瓊脂擴散和電泳技術結合在一起的方法稱為對流免疫電泳。【實驗材料】1．電泳緩沖液：pH8.6巴比妥-鹽酸緩沖液。2．抗體：抗AFP。3．抗原：AFP陽性血清、待檢病人血清。4．1％瓊脂用pH8.6巴比妥-鹽酸緩沖液配制，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

5．電泳儀、電泳槽、載玻片、打孔器、10ml吸管、移液器、移液頭。

【實驗方法】

1．制板2．打孔3．加樣將抗原加入瓊脂板上有標記孔側的小孔中，抗體加入另一側小孔中，以加滿為度，不可溢出孔外。(如圖示)4．電泳將加好樣品的瓊脂板置電泳槽上，抗原側置陰極端，抗體孔側置陽極端。搭好橋后，接通電源，控制電壓6～10V/cm板長，電泳約30～60min。5．關閉電源，取出瓊脂板，觀察結果。

AgAbAgAb標記孔沉淀線【實驗結果】將玻片對著強光源，先觀察AFP陽性血清孔與抗體孔之間的白色沉淀線，然后再觀察待檢血清孔與抗體孔之間是否也有沉淀線出現(xiàn)，如有沉淀線，則表示AFP試驗陽性，否則AFP試驗為陰性?！咀⒁馐马棥?．電泳時電流不宜過大，以免蛋白變性。2．抗原和抗體的電極方向不能搞錯。3．抗原和抗體的濃度要適當，抗原太濃或太稀都不易出現(xiàn)沉淀線。4．電泳所需時間與孔間距離有關，距離越大，電泳時間越長?！緦嶒炈伎肌?．單向擴散與火箭電泳、雙向擴散與對流免疫電流比較各有何特點？2．對流免疫電泳中，抗原為何放陰極端，抗體為何放陽極端？

外周血單個核細胞的分離

【實驗目的】1．熟悉免疫細胞分離的常用方法。

2．掌握外周血單個核細胞分離方法的原理、操作規(guī)程?！緦嶒炘怼咳送庵苎獑蝹€核細胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）包括淋巴細胞和單核細胞。單個核細胞的體積、形態(tài)和比重與外周血其他細胞不同。因此利用一種介于1.075～1.090之間而近于等滲的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque）混合分離液作密度梯度離心，離心后不同比重的血細胞在分離液中呈梯度分布。從而分離出PBMC。【實驗材料】1．肝素溶液用生理鹽水將肝素配成125～250U/ml的溶液，置4℃下保存?zhèn)溆谩?．淋巴細胞分層液市售或自配，20℃時密度應為(1.077±0.001)g/L。3．Hanks平衡鹽溶液（HBSS）或磷酸鹽緩沖液（PBS）pH7.2～7.4。4．完全RPMI-1640培養(yǎng)液。5．15ml或50ml錐底離心管。6．水平離心機，顯微鏡。7．玻璃吸管，滴管，細胞計數板等。8．2％臺盼藍染液?！緦嶒灧椒ā?/p>

1．采集靜脈血若干毫升（隨需要而定），注入盛有肝素的無菌小瓶中（每ml全血加0.1ml肝素溶液），加蓋后立即輕輕搖勻，使血液抗凝。2．用吸管加入等體積的室溫HBSS或PBS，使血液等倍稀釋。（此步驟亦可省去）3．吸取淋巴細胞分層液（每10ml稀釋血加5m1分層液）置于15m1或50m1離心管中，然后將離心管傾斜45°角，將稀釋血液在距分層液界面上1cm處沿試管壁緩慢加至分層液上面。應注意保持兩界面清晰，勿使血液混入分層液內。

4．將離心管置水平式離心機內，在18～20℃下，以2000r/min離心30min，離心后，