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文檔簡介

肝病蛋白質(zhì)組學(xué)研究

劉殿武河北醫(yī)科大學(xué)公衛(wèi)學(xué)院2014.6蛋白質(zhì)組學(xué)是干什么的?蛋白質(zhì)組學(xué)研究解決什么問題?黑猩猩與人染色體差異1.23%(Science,2002)差異否?蛋白質(zhì)組學(xué)是干什么的?研究不同物種間差異研究同種具有不同特征物種間差異研究物種進(jìn)化不同階段的差異

物種間蛋白質(zhì)差異IntroductionApplicationResearchexample123Introduction隨著基因組研究的進(jìn)一步深入,人們越來越清晰地知道了人類的全部遺傳密碼即基因組序列,這是否意味著人類可以任意控制人的生老病死呢?人類基因組計劃(humangenomeproject,HGP)是由美國科學(xué)家于1985年率先提出,于1990年正式啟動的。美國、英國、法蘭西共和國、德國、日本和我國科學(xué)家共同參與了這一預(yù)算達(dá)30億美元的人類基因組計劃。2001年得到人類基因組序列的"草稿",2003年得到最后"定稿"

人類基因組計劃DNAmRNAProteinsCellfunctionsProteome“Proteomics”Genome“Genomics”什么是蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)是一種復(fù)雜的有機(jī)生物大分子,它們是生命活動的實際執(zhí)行者。蛋白質(zhì)由一個一個的氨基酸首尾相接形成肽鏈,肽鏈再折疊形成一定空間結(jié)構(gòu)。

什么是蛋白質(zhì)??什么是蛋白質(zhì)組?

蛋白質(zhì)組“proteome”一詞源于“PROTEin”與“genOME”的雜合。是指“由一個基因組、一種生物或一個細(xì)胞/組織的基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)”。熒光染色的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)蛋白組學(xué)的研究方法

分離技術(shù)鑒定技術(shù)功能研究Introduction

樣品制備技術(shù)

一、樣品制備技術(shù)蛋白樣品制備的一般要求1.應(yīng)使所有待分析蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài),且制備方法應(yīng)具有重現(xiàn)性。2.保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài),避免溶解性低的蛋白質(zhì)在等點聚焦時由于溶解度降低而沉淀析出。3.排除多糖、核酸、脂類其他干擾分子;同時避免處理環(huán)境對蛋白質(zhì)的污染。4.防止樣品處理過程中發(fā)生蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾,包括蛋白質(zhì)降解、蛋白酶或尿素?zé)岱纸夂笠鸬男揎棧?.盡量去除起干擾作用的高峰度或無關(guān)蛋白,保證待研究蛋白在可檢測水平6.盡可能縮短樣品的處理時間,盡可能在低溫環(huán)境中處理。常用的處理方法1.細(xì)胞的洗滌2.細(xì)胞的破碎裂解3.除去污染物4.微透析5.電泳脫鹽6.蛋白沉淀

1.細(xì)胞的洗滌

目的:去除污染物常用的緩沖液:PBS注意:保持適當(dāng)?shù)臐B透壓,避免細(xì)胞溶解。2.細(xì)胞的破碎裂解

不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織,其細(xì)胞破碎的難易不一,使用的方法也不相同,如動物臟器的細(xì)胞膜較脆弱,容易破碎,植物和微生物由于具有堅固的纖維素、半纖維素組成的細(xì)胞壁,要采取專門的破碎方法。各種細(xì)胞破碎方法的應(yīng)用范圍3.除去污染物

DNA/RNA脂類污染物的種類鹽固體雜質(zhì)4.微透析

常用于小體積樣品膜的截留分子量8000Da5.蛋白沉淀

目的:低濃度蛋白可以得到濃縮;有時可以去除某些干擾物質(zhì);抑制蛋白酶活性;方法:硫酸銨沉淀法;三氯乙酸沉淀法;丙酮沉淀法;丙酮/三氯乙酸沉淀法;二、分離技術(shù):1.Two-dimensionalProteinElectrophoresis(2DE)分離技術(shù)2.熒光差異顯示雙向電泳(Fluorescence2Ddifferentialgelelectrophoresis,F(xiàn)-2DDIGE)這是一種定量分析凝膠上蛋白質(zhì)點的新方法.它是將待比較的兩種樣品提取的總蛋白質(zhì)分別與兩種不同的熒光標(biāo)記試劑(Cy2、Cy3或Cy5)進(jìn)行共價標(biāo)記,然后將不同熒光染料標(biāo)記的兩種待比較的蛋白質(zhì)樣品等量混合,上樣進(jìn)行雙向電泳,2D凝膠在成像儀上用兩種不同波長激發(fā),并將兩種樣品的熒光圖譜顯示成像,用2D分析軟件進(jìn)行定量分析。將定量上顯示有明顯差異的蛋白質(zhì)點切下后進(jìn)行鑒定分析,從而確定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。三、鑒定技術(shù)1.質(zhì)譜技術(shù)2.同位素親和標(biāo)簽(isotope-codedaffinitytags,ICAT)

一種定量研究蛋白質(zhì)表達(dá)譜的新方法。ICAT是一種人工合成的化學(xué)試劑。ICAT反應(yīng)基團(tuán)與蛋白質(zhì)的Cys殘基共價結(jié)合,充分反應(yīng)后,將兩種標(biāo)記后的蛋白等量混合,再用胰蛋白酶解。經(jīng)抗生物素的親和層析純化后,含生物素的ICAT酶解片段可以進(jìn)行在線HPLC-MS/MS分析。IntroductionApplicationResearchexample123應(yīng)用價值1.癌癥目前用到的腫瘤標(biāo)志物,從19世紀(jì)鑒定的骨髓瘤的本周氏蛋白到上皮癌細(xì)胞系腫瘤特異性抗體都是基于蛋白組學(xué)的方法得到的。對于與癌有關(guān)的蛋白來說,用多種抗體可以使我們了解該通路中的蛋白特征,例如,一些癌基因產(chǎn)物或細(xì)胞周期蛋白的過表達(dá)或者是翻譯后修飾可以在轉(zhuǎn)化的肝細(xì)胞中檢測到.

2.感染性疾病近年來,除結(jié)核、多重耐藥鏈球菌感染及機(jī)會致病菌外,出現(xiàn)了一些新的感染因素如HIV、埃博拉病毒等。因此這些致病微生物的蛋白質(zhì)組分析,對于了解其毒性因子、抗原及疫苗的制備非常重要,此外對疾病的診斷、治療和預(yù)防也同樣重要。

3.其他疾病

如擴(kuò)張型心臟疾病,目前其發(fā)病機(jī)理不明,推測可能為多種因素所致。Knecht等采用2-DE取得了3300個心肌蛋白條帶,通過氨基酸序列分析、Edman降解法及基質(zhì)輔助的激光解吸離子化質(zhì)譜(MALDI-MS)等分析了其中150條。經(jīng)活檢及術(shù)后病理證實,有12條為擴(kuò)張性心肌病特有的蛋白。但具體資料尚在進(jìn)一步分析之中。ApplicationinDiagnosis應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)對乳頭吸液(nippleaspiratefluid,NAF)標(biāo)本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,結(jié)果顯示,在乳腺癌和正常乳腺的NAF中有5種差異表達(dá)蛋白質(zhì),其中6.5kD和15.9kD的蛋白質(zhì)敏感性和特異性最好,在乳腺癌患者中陽性率為25%-84%,而在正常人中陽性率為0-9%。將NAF的蛋白質(zhì)組學(xué)分析與乳腺X線攝影和物理檢查結(jié)合可提高乳腺癌的早期診斷率。ApplicationinDiagnosisSELDI-TOF-MS分析82例肝硬化患者(其中38例不伴有HCC,44例為HCC)血清,鑒定了一種分子量為8900D的蛋白在HCC組織表達(dá)上調(diào),此蛋白峰的強(qiáng)度與腫瘤的大小成正比。體外實驗證實,此蛋白為玻連蛋白的羧基末端,在HCC表達(dá)增高,可反映HCC的侵襲性。因此,玻連蛋白的羧基末端多肽可望成為HCC新的血清標(biāo)記物。利用血清蛋白質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)了能夠提高結(jié)核診斷率的標(biāo)志物ApplicationinDiagnosisApplicationinmechanism通過對HIV陽性患者及正常人外周血單核細(xì)胞差異性蛋白分析,得到黏著斑蛋白、裸蛋白等潛在標(biāo)志物,促進(jìn)了對HIV潛在機(jī)制的研究。ApplicationinTreatment

白血?。?/p>

白血病是血液系統(tǒng)的常見惡性腫瘤,臨床上分型較多,而不同的亞型之間,所用的治療方案不同,其預(yù)后結(jié)果也不相同,所以白血病的分型顯得尤為重要。

為了明確急性白血病FAB分型中所涉及的關(guān)鍵蛋白,對61例急性白血病患者進(jìn)行篩查,發(fā)現(xiàn)髓系相關(guān)蛋白8和14僅在M2和M3型中高表達(dá)。因此,這兩種標(biāo)志物蛋白可以作為急性髓系白血病(AML)分型標(biāo)志蛋白,有利于選擇正確的治療方案。ApplicationinTreatment

直腸癌:

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可用于直腸癌手術(shù)前分子分期,對判斷結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有重要意義。徐文鴻等應(yīng)用SELDI-TOF-MS,分析了76例結(jié)直腸癌患者的血清標(biāo)本,建立并驗證了分期模型。通過SELDI-TOF-MS技術(shù)所篩選的候選腫瘤標(biāo)志物可以指導(dǎo)大腸癌的綜合治療,所建立的診斷模型可以輔助臨床明確大腸癌的術(shù)前分期。網(wǎng)上蛋白質(zhì)組學(xué)資源

蛋白質(zhì)組研究技術(shù)、信息等。

從新藥開發(fā)角度,發(fā)現(xiàn)新蛋白及新作用。

可以找到蛋白質(zhì)組研究相關(guān)企業(yè)、各種儀器來源、新聞等。

teome.co.uk各種蛋白質(zhì)組研究相關(guān)信息

http://www.micromass.co.uk介紹蛋白質(zhì)鑒定的先進(jìn)儀器

.au蛋白質(zhì)鑒定專家系統(tǒng),AustralianProteomeAnalysisFacility

http://expasy.cbr.nrc.ca蛋白質(zhì)鑒定專家系統(tǒng),CanadianBioinformaticsResourceIntroductionApplicationResearchexample123

InvestigationandIdentificationofdisease-relatedpeptideinserafrompatientswithchronichepatitisB

慢性乙肝相關(guān)肝病差異蛋白的查找選擇研究的疾病本研究:選擇急慢性乙肝、肝硬化和肝癌。獲取樣品血清樣品質(zhì)量很重要:采血前要確認(rèn)病人是否空腹采血和盛放血液裝置無無機(jī)物、無任何抗凝或血沉物質(zhì)等干擾實驗。防止溶血、乳靡、絮狀沉淀等血清樣本在采血后3小時內(nèi)處理并冷凍。血清分裝后,-80℃儲藏。-20℃存放時間太長影響實驗結(jié)果。液體芯片分離蛋白ClinProtBeadsClinProtBeadsClinProtBeads疏水型MB-HIC1

MB-HIC3MB-HIC8

MB-HIC18弱陽離子弱陰離子MB-WCX

MB-WAX金屬離子MB-IMAC-Fe

MB-IMAC-Cu質(zhì)譜分析Clinprotools軟件分析VisualcomparisonStatisticalinformationBestseparatingpeaksacc.T-testDiseasedHealthy差異蛋白發(fā)現(xiàn)疾病診斷模型建立和診斷CHBgroupAHB

group49distinguishedprotein急性乙型肝炎和慢性乙肝炎患者血清蛋白質(zhì)組的比較差異最明顯的前10位蛋白進(jìn)行分組效率計算4154Da4210Da聯(lián)合應(yīng)用診斷急性乙肝靈敏度、特異度、驗證正確率分別達(dá)到100%、84.21%、86.67%4210Da蛋白圖.MALDI-TOF質(zhì)譜分析得到的

4210Da圖像.

(A)四組病人4210Da蛋白的堆積圖,ClinProtTools?2.1軟件分析。(B)四組病人中4210Da的平均相對強(qiáng)度,ClinProtTools?2.1軟件分析

紅色:急性肝炎

綠色:慢性肝炎

藍(lán)色:肝硬化

黃色:肝癌

(C)SPSS15.0軟件分析。4210Da蛋白急性乙肝病人血清蛋白質(zhì)組的追蹤觀察B、G兩位病人轉(zhuǎn)為慢性A、E兩位病人痊愈追蹤觀察AHB患者,有4例達(dá)到觀察終點慢性乙肝輕、中、重型患者血清蛋白質(zhì)組的比較共發(fā)現(xiàn)29個差異蛋白慢性重型慢性中型慢性輕型無差異,合并VS靈敏度、特異度、驗證正確率分別達(dá)到100%、88.89%、93.42%1866Da單獨應(yīng)用診斷慢性乙肝重型差異最明顯的前10位蛋白進(jìn)行分組效率計算1866Da蛋白圖1.不同程度慢性肝炎病人的分布。(A)輕度(×)和中度(○)重疊比較多,可以聯(lián)合到一組。(B)聯(lián)合組(×)和重度組(□)可以明顯的區(qū)分開。1866Da蛋白在合并組和重型組具有明顯差異重型合并慢性乙肝(CHB)、肝硬化(LC)、肝癌(HCC)患者血清蛋白質(zhì)組的比較分析

CHB組

HCC組9個差異蛋白對9個差異蛋白進(jìn)行分組效率計算11243Da4210Da聯(lián)合應(yīng)用診斷HCC靈敏度、特異度、驗證正確率分別達(dá)到92.86%、77.63%、80.00%從CHB患者中間查找HCC患者更具臨床意義當(dāng)CHB進(jìn)展到LC階段時,其病理改變和嚴(yán)重性均已與HCC非常接近LC組

HCC組1個差異蛋白(2093Da)根據(jù)氨基酸序列,4210Da蛋白被鑒定為“Gene_Symbol=GSPT2EukaryoticpeptidechainreleasefactorGTP-bindingsubunitERF.4210蛋白氨基酸序列鑒定結(jié)果(36肽)1866Da蛋白經(jīng)檢索鑒定為補(bǔ)體3的一個片段

4210Da多肽功能研究eRF3b/GSPT2診斷價值的研究血液提取RNA熒光定量檢測GSPT2的相對表達(dá)量Fig.1TheexpressionofGSPT2/18sRNAinbloodofHBV-relateddiseasesTable2TheexpressionofGSPT2/18sRNAinbloodofnormalcontrolandHBVrelateddiseasesFig.2Receiver–operatorcurvesofbloodGSPT2indifferentiatingLC(left)and/orHCC(right)fromCHBgroup.TheareaunderthecurveforGSPT2is0.738(left)and0.751(right).Theop

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