分子病理學(xué)技術(shù)進(jìn)展及臨床應(yīng)用課件

分子病理學(xué)技術(shù)進(jìn)展及臨床應(yīng)用

(第一部分)分子病理學(xué)技術(shù)進(jìn)展及臨床應(yīng)用

(第一部分)來(lái)自臨床的問(wèn)題來(lái)自臨床的問(wèn)題ContemporaryUnderstandingofCarcinogenesisbymolecularbiologyasourintroductionContemporaryUnderstandingofMorethan100yearsago(1830),BritishphysicianThomasHodgkindiscoveredatypeofLymphomawithhisnakedeyes.Inthetime,obviouslyThomasHodgkindidneverknowR-Scellsinhiscasesbeforethemicroscopeavailableinclinic.Morethan100yearsago(1830)分子病理學(xué)技術(shù)進(jìn)展及臨床應(yīng)用課件分子病理學(xué)技術(shù)進(jìn)展及臨床應(yīng)用課件Whileatpresenttime,forus,whatcanbedownwithournakedeyesratherthenwithmicroscopeormodernmoleculartechniques?Whileatpresenttime,foruThecellularelementsin

lymphoid&hematopoietictumorsarethekeytounderstandanddiagnosetheirdiseases.Evenmore,themoleculesintherelatedcellsarethekey,especiallyinvolvedinthedevelopmentanddifferentiationoflymphoid&hematopoieticcellsThatisthebeginningofourstorytoday.ThecellularelementsinlymphUnderstandingofLymphocyteDevelopment

1950s-2010structureandfunctionoflymphoidtissueGermenalCenter(GC)：structure，function，transformationCapsularandafferentlymphaticsCortexCortexMedullaHilusEfferentlymphaticvesselsTrabeculaeMedullarysinusesMedullarycordsGCFollicleThymus-dependingzone

Subcapsularsinus

ReticulumsupportinglymphatictissueUnderstandingofLymphocyteDe分子病理學(xué)技術(shù)進(jìn)展及臨床應(yīng)用課件分子病理學(xué)技術(shù)進(jìn)展及臨床應(yīng)用課件Couldyourecognizethefollowingcellularelementsinlymphnode?GerminalcenterMantlezoneMarginalzone

T-zone

CouldyourecognizethefollowUnderstandingbasedon70’soflastCenturyInterfolliclezoneTlymphocyteTlmmunocyteBlmmunocyteLymphocytetransformincenterofFollicleMemorycellPlasmacellParadigmofLymphocytetransformBlymphocyteFDCBnon-cleavedcellBcleavedcellOnlybymorphologyUnderstandingbasedon70’sofCentroblastBlastImmuoblastMacrophageFDCCentrocyteTcellMacrophageFDCLennert’sPresumptionbasedon80’soflastCenturyGerminalcenterDarkzoneLightzoneMantlezone

Mantlezone

Marginalzone

ProliferationzoneSelectedforapoptosisOn-goingmutationbymorphologyandimmunotypingconsideringmoleculareventsCentroblastCentrocyteLennert’sUpdatetoB-lymphocytedevelopmentmodelin2000’sUpdatetoB-lymphocytedevelopBcelldifferentiationbyimmuno-markers

BcelldifferentiationbyimmuBcelldifferentiationwithanatomicalsitesofvariousstages

BcelldifferentiationwithanCouldyourecognizecellularelementsasfollows

inlymphnode?GerminalcenterMantlezoneMarginalzone

T-zone

CouldyourecognizecellulareUnderstandingofBcelldifferentiationuntil2005byHSteinUnderstandingofBcelldifferNaiveBcellDCSomaticHypermutation/AffinityMaturationClassSwitchingIGM→IgG,IgAMemoryBcellPlasmacellApoptosisGerminalCenterV(D)JrecombinationApoptosisAntigenDCCentroblastsCentrocytesBoneMarrowPost-GerminalCenterBBBBBBBBBBTTPrecursorBLymphoblastBCL2↑IRF4↑BCL2↓BCL6↑DecreasedAffinityIncreasedAffinityBCL6↓NoBCRTcell-richzoneIntactBCR?IgHV clonalrearrangement somatichypermutation!NaiveBcellDCSomaticHypermutWhathappentoTcellsinceithasbeenlessmentioned

WhathappentoTcellsinceitThecontemporaryunderstandingofBandTcelldifferentiation2009-2010Understandingofthelymphocytedifferentiationandtransformationbymultipleapproachesinl.morphology,immunotypingandmolecularmeans.Thecontemporaryunderstanding一、臨床分子病理學(xué)常用方法免疫組織化學(xué)基因克隆性重排的檢測(cè)FISH及CGH等位基因不平衡分析雜合性缺失（LOH）的檢測(cè)微衛(wèi)星DNA不穩(wěn)定性（MSI）的檢測(cè)Forpost-graduateprogramClinicalpathology-ZR-201509一、臨床分子病理學(xué)常用方法免疫組織化學(xué)Forpost-gr（一）免疫組織化學(xué)及其應(yīng)用（一）免疫組織化學(xué)及其應(yīng)用1．免疫組織化學(xué)的相關(guān)理論和技術(shù)1．1．免疫組織化學(xué)的工作原理

已知的特異性抗體或抗原能特異性結(jié)合通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記于結(jié)合后的特異性抗體上的顯示劑，如酶，金屬離子、同位素等，顯示一定的信號(hào)（如：顏色）借助顯微鏡、熒光顯微鏡或電子顯微鏡觀察其顏色變化，從而在抗原抗體結(jié)合部位確定組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)1．免疫組織化學(xué)的相關(guān)理論和技術(shù)Forpost-graduateprogramClinicalpathology-ZR-Forpost-graduateprogram2．2．免疫組織化學(xué)的應(yīng)用范圍及優(yōu)點(diǎn)：2．2．1．應(yīng)用范圍：(1)提高病理診斷準(zhǔn)確性(2)對(duì)疾病的預(yù)后和治療的意義激素(3)癌基因蛋白的應(yīng)用(4)對(duì)腫瘤增生程度的評(píng)價(jià)ki-67,PCNA(5)微小病灶的發(fā)現(xiàn)微小癌，微小病灶（如羊水栓塞）(6)在腫瘤分期上的意義(7)指導(dǎo)腫瘤的治療(8)免疫性疾病的輔助診斷(9)病原微生物的檢測(cè)Forpost-graduateprogramClinicalpathology-ZR-20142．2．免疫組織化學(xué)的應(yīng)用范圍及優(yōu)點(diǎn)：Forpost-gr2．常用免疫組織化學(xué)方法：A、一步法B、二步法C、三步法D、多步法間接法金銀法PAP和BigBeeAPAAPABC法

EnVision法BT法（CSA：Catalyzedsignalamplification）1:50、1:200、1:500、1:500、1:1000、1:5000、1:5000,1:106

2．常用免疫組織化學(xué)方法：E.ABC法

E.ABC法F.EnVision近年來(lái)的新方法:F.EnVision近年來(lái)的新方法:G.CSA法（Catalyzedsignalamplification）BT法G.CSA法（CatalyzedsignalamForpost-graduateprogramClinicalpathology-ZR-20120910Forpost-graduateprogramCSA原理圖CSA法CSA原理圖CSA法H.免疫組化-原位雜交的聯(lián)合應(yīng)用H.免疫組化-原位雜交的聯(lián)合應(yīng)用I.TUNEL-免疫組化在細(xì)胞凋亡檢測(cè)中的應(yīng)用

凋亡是一個(gè)基因調(diào)控、耗能的主動(dòng)過(guò)程，也稱(chēng)之為程序性細(xì)胞死亡(programmedcelldeath，PCD)。

凋亡是單個(gè)細(xì)胞或數(shù)個(gè)細(xì)胞的死亡，死亡細(xì)胞的質(zhì)膜(細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜)不破裂，不引發(fā)死亡細(xì)胞的自溶，也不引起急性炎癥反應(yīng)。I.TUNEL-免疫組化在細(xì)胞凋亡檢測(cè)中的應(yīng)用形態(tài)學(xué)特點(diǎn)：

電鏡下，凋亡的細(xì)胞皺縮，質(zhì)膜完整，胞漿致密，細(xì)胞器密集、不同程度退變；核染色質(zhì)致密，形成形狀不一、大小不等的團(tuán)塊邊集于核膜處，進(jìn)而胞核裂解、胞漿多發(fā)性芽突；胞漿芽突迅速脫落，形成許多凋亡小體（apoptoticbodies）。凋亡小體外被以胞膜，其胞漿中含有細(xì)胞器，核碎片可有可無(wú)。凋亡小體迅即在局部被巨噬細(xì)胞和相鄰的其他細(xì)胞(例如上皮細(xì)胞)吞噬、降解。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的超微形態(tài)比較。

光鏡下，凋亡細(xì)胞胞漿濃縮，強(qiáng)嗜酸性，可有可無(wú)固縮深染的核碎片，故有稱(chēng)之為嗜酸性小體（councilmanbodies）。形態(tài)學(xué)特點(diǎn)：生化特點(diǎn)：

由基因調(diào)控，是耗能的主動(dòng)過(guò)程

Ca2+/Mg2+依賴(lài)的核酸內(nèi)切酶活化

DNA斷裂以核小體為單位

DNA電泳呈階梯狀圖譜生化特點(diǎn)：由基因調(diào)控，是耗能的主動(dòng)過(guò)程TUNEL法檢測(cè)凋亡（TerminalDeoxynucleotidylTransferase-mediateddUTPnick-end-labling）TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記TdT酶(TerminalDeoxynucleotidylTransferase)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TUNEL）TUNEL法檢測(cè)凋亡TdT酶(TerminalDeoxyTUNEL法示意間接法：Digoxigenin-dUTPTUNEL法示意TUNEL染色：直接法參照德國(guó)寶靈曼公司原位末端標(biāo)記試劑盒操作手冊(cè)，其主要步驟如下：（1）切片脫蠟至水，雙蒸水、PBS液洗；（2）微波處理：切片置于盛有枸椽酸緩沖液（0.01M，PH6.0）的容器中微波加熱.（3）PBS液洗5min×3次；（4）每張切片滴加20ug／ml蛋白酶K液，放于濕盒中37℃孵育15min；（5）切片置于0.3%H2O2-甲醇液中室溫放置20-25min；（6）滴加TUNEL反應(yīng)混合液，37℃濕盒中孵育60-90min；TUNEL反應(yīng)混合液主要成分：Bio-11-dUTPTdT酶（7）PBS液洗5min×3次；（8）滴加鏈霉菌素—辣根過(guò)氧化物酶液（用PBS液稀釋成1:200）37℃濕盒中孵育30min，（9）滴加新鮮配制的DAB-H2O2液，鏡下觀察2-10min顯色；（10）自來(lái)水充分洗滌；TUNEL染色：直接法免疫組化多重標(biāo)記的應(yīng)用以EnVision方法為例Forpost-graduateprogramClinicalpathology-ZR-2014免疫組化多重標(biāo)記的應(yīng)用以EnVision方法為例Forpo免疫組化多重標(biāo)記的應(yīng)用在淋巴瘤研究中的應(yīng)用ABC-DAB/SAB-AP-vectorblue示：CD30+H/RS細(xì)胞表達(dá)P53、BCL-22.ABC-DAB/SAB-AP-vectorred示：H/RS細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞的分布情況。3.TUNEL-DAB/SAB-AP-vectorred示:CD30+H/RS細(xì)胞免疫組化多重標(biāo)記的應(yīng)用在淋巴瘤研究中的應(yīng)用4．免疫組織化學(xué)的質(zhì)量控制及方案設(shè)計(jì)4．1．Ab的保存和配制保存性分裝即用型配制：選最佳點(diǎn)4．免疫組織化學(xué)的質(zhì)量控制及方案設(shè)計(jì)4．2．正確的設(shè)計(jì)和結(jié)果判斷1.試劑對(duì)照確定第一抗體和第二抗體是否具有抗原特異性。其中要確定第一抗體對(duì)陽(yáng)性組織的最佳稀釋度；第二抗體對(duì)組織蛋白的無(wú)反應(yīng)性。陰性試劑對(duì)照：

用一個(gè)陰性試劑替代一抗或控制步驟目的：用來(lái)評(píng)價(jià)非特異性染色，并較好解釋抗原部位的特異性標(biāo)記。4．2．正確的設(shè)計(jì)和結(jié)果判斷Forpost-graduateprogramClinicalpathology-ZR-2014Forpost-graduateprogram2.組織對(duì)照陰性組織對(duì)照：例如:正常肝組織用于對(duì)照HBsAg陽(yáng)性的肝細(xì)胞檢測(cè)再者,如果大規(guī)模使用抗體，一張切片的陰性區(qū)，可能就是另一張切片（不同Ab）的非特異性染色對(duì)照。陽(yáng)性組織對(duì)照：有已知的、含目標(biāo)抗原的樣本目的：監(jiān)控抗原是否存在；監(jiān)控抗原敏感性是否喪失。組織內(nèi)對(duì)照：可以消除不同組織間固定造成的差異，另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以不使用陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本。

2.組織對(duì)照陰性試劑對(duì)照陰性組織對(duì)照陽(yáng)性組織對(duì)照組織內(nèi)對(duì)照研究組+--++-定位+/-+/-理論預(yù)期實(shí)測(cè)值非定位意義？Forpost-graduateprogram