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免疫熒光操作步驟(漂片,冰凍切片)免疫組化步驟:將腦片放到,6孔板(或12孔板),按照二抗說明書,加3%雙氧水封閉10min(如果是從切片保護(hù)液取出,則要用PBS洗一遍);(二抗不同,操作步驟有差別),本實(shí)驗(yàn)室使用的二抗試劑盒為中杉金橋超敏二步法試劑盒;吸去雙氧水,PBS洗兩遍,將腦片周圍的水用吸水紙或衛(wèi)生紙擦凈,注意不要碰到腦片;然后按照一抗說明書,將一抗按比例稀釋,加入稀釋后的一抗,一般,大鼠腦片一張需 50微升一抗稀釋液,小鼠腦片為30微升;注意不要讓液體流到邊上;如果流到邊上,要重新加或者加大量,使腦片完全浸入液體;然后,4C,過夜(18h或者24h),不建議使用37C;然后,PBS洗凈兩遍;剩下步驟見二抗試劑盒說明書。DAB配方為:lOmgDAB固體加到20ml0.01MPBS,臨用時(shí)加100-200微升30%雙氧水,注意避光。顯色10min,看片子染色深淺情況適當(dāng)調(diào)整顯色時(shí)間。一般 3分鐘顯色就比較明顯,如果20分鐘仍未顯色,則看下面的參考。然后PBS洗兩遍,轉(zhuǎn)移到載玻片,自然晾干。干燥天氣 2-3h,潮濕天氣3-4h。脫水:70%酒精3min,95%酒精3min,100%酒精3min,100%酒精2min,二甲苯2min,二甲苯3-5min。如果片子上鹽分較多,在70%酒精前在雙蒸水1min。免疫熒光步驟及注意事項(xiàng):將腦片放到6空板的山羊血清封閉液中,封閉 20-40min;(如果是從切片保護(hù)液取出,則要用 PBS洗一遍)吸去山羊血清,PBS洗兩遍,將腦片周圍的水用吸水紙或衛(wèi)生紙擦凈,注意不要碰到腦片;然后按照一抗說明書,將一抗按比例稀釋,加入 PBS稀釋后的一抗,一般,大鼠腦片一張需 50微升一抗稀釋液,小鼠腦片為30微升;注意不要讓液體流到邊上;如果流到邊上,要重新加或者加大量,使腦片完全浸入液體;4C,過夜(18h或者24h),不建議使用37C,如果熒光亮度不強(qiáng),可以延長孵育時(shí)間到 48或72小時(shí);然后,PBS洗凈兩一一三遍,按照二抗說明書稀釋的熒光二抗,室溫孵育 2小時(shí)。注意避光操作。0.01MPBS洗兩遍,轉(zhuǎn)移到載玻片上,避光自然晾干;滴加防淬滅劑后,蓋上蓋玻片鏡下觀察。常見問題:熒光太暗:可能蛋白表達(dá)少;可能一抗孵育時(shí)間短;二抗孵育時(shí)間短;清洗次數(shù)過多;溶液 pH不合適;熒光萃滅;一抗?jié)舛冗^低或過高;二抗?jié)舛冗^低或過高;激發(fā)波長不在抗體適用波段。背景熒光太深:一抗?jié)舛冗^高,清洗不徹底;二抗?jié)舛冗^高,清洗不徹底;封閉時(shí)間過短,非特異性過強(qiáng);一抗非特異性過強(qiáng);二抗非特異性過強(qiáng);顯微鏡熒光強(qiáng)度過強(qiáng)??傊畬?shí)驗(yàn)是喜歡強(qiáng)陽性,不喜歡假陰性,呵呵。任何實(shí)驗(yàn)都需要花時(shí)間摸索才能找到其最佳的工作條件。另附免疫組化常見問題解析。原理是相同的,只是最后的顯色方法不一樣,有些問題有啟發(fā)作用。免疫組織化學(xué)邊緣效應(yīng)?原因:1)組織邊緣與玻片粘貼不牢,邊緣組織松脫漂浮在液體中,每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致 .解決辦法:制備優(yōu)質(zhì)的膠片(APES或多聚賴氨酸),切出盡量薄的組織切片,不厚于 4微米,組織的前期處理應(yīng)規(guī)范,盡量避免選用壞死較多的組織。2)切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織,邊緣的試劑容易首先變干,濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法:試劑要充分覆蓋組織,應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時(shí),為了避免油劑的影響,畫圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些?如何解決?抗體孵育時(shí)間過長、抗體濃度高易增加背景著色。解決辦法:這可通過縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色,建議試用單克隆抗體看看。內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細(xì)胞多的組織),需要通過延長滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色;非特異性組分與抗體結(jié)合,這需要通過延長二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果;DAB孵育時(shí)間過長或濃度過高;PBS沖洗不充分,殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色,在一抗、二抗或 SP孵育之后的浸洗尤為重要;標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片,這容易增強(qiáng)非特異性著色。免疫組化染色呈陰性結(jié)果的原因有哪些?1、抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯(cuò)誤。不知抗體是進(jìn)口的還是國產(chǎn)的工作液,怎么這么高稀釋度也沒能做出陽性結(jié)果?另外不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽性結(jié)果,抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng),必須摸索最佳濃度。2、抗原修復(fù)不全,對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位,以利于與抗體結(jié)合 ;建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過實(shí)驗(yàn),這是最佳的時(shí)間和次數(shù)。若不行,還可高壓修復(fù)。3、組織切片本身這種抗原含量低;4、血清封閉時(shí)間過長。5、 DAB孵育時(shí)間過短。6、 細(xì)胞通透不全,抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。7、開始做免疫組化,我建議你一定要首先做個(gè)陽性對(duì)照片,排除抗體等外的方法問題。背景強(qiáng)的原因?1,考慮一抗?jié)舛雀撸?,然后調(diào)整DAB孵育時(shí)間;3,也要考慮血清封閉時(shí)間是否過短適當(dāng)增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長浸洗時(shí)間等。DAB顯色真的需要3-10分鐘嗎?我之前做的顯色40秒就夠了,再多本底就太深,現(xiàn)在做另一個(gè)顯色3分鐘也不出,真的有必要延長顯色時(shí)間嗎?DAB顯色時(shí)間不是固定的,主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間,到出現(xiàn)淺棕色本底時(shí)即可沖洗;DAB顯色時(shí)間很短(如幾秒或幾十秒)就出現(xiàn)很深的棕褐色,這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時(shí)間過長,需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間;此外,若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深,還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全,需要延長封閉時(shí)間;DAB顯色時(shí)間很長(如超過十幾分鐘)才出現(xiàn)陽性染色,一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時(shí)間過短(最好一抗4度過夜);另一方面就是封閉時(shí)間過長。石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象?,1烤片時(shí)間不夠,或溫度不夠,可以延長烤片時(shí)間和提高烤片溫度二,用含有多聚賴氨酸的玻片,可以購買到或這自己做三,有些組織本身就容易掉片,如骨組織等,操作時(shí)沖 PBS不要直接沖到組織上,沖到組織上方,讓它流下沖洗組織,四,用高溫修復(fù)時(shí),溫度驟冷也可能引起。年前爬的細(xì)胞片在-20度放了半年(保鮮膜密封),現(xiàn)在取出來再作,做了兩次,步驟均是按以前的作的,但今天做時(shí),原來顯色很強(qiáng)的片子現(xiàn)在顯色很弱了,問什么呢?是不是片子放的時(shí)間太長了?抗體在 4度放的時(shí)間也不長而且這次濃度比以前做的還高?首先,抗體濃度和孵育時(shí)間在免疫組化中至關(guān)重要。在抗原抗體反應(yīng)并非抗體濃度越高,反應(yīng)越強(qiáng)烈,這叫前帶現(xiàn)象。所以選擇最佳的一抗?jié)舛群头跤龡l件也是十分重要的,其實(shí)抗體濃度過高或過低均會(huì)引起陰性。我到認(rèn)為你這片子的影響可能更大。盡管在 -20度保存,但是時(shí)間一般超過3個(gè)月就不能保證其中抗原的丟失,建議可以重新爬片,以排除方法和抗原的原因。你說抗體放在4度保存是指未稀釋還是稀釋后抗體,存放多長時(shí)間?一般稀釋后抗體不能保存很長時(shí)間的。為什么切片傾斜,抗體分布不均勻,就會(huì)造成一半陽性,一半陰性?我認(rèn)為,即使切片傾斜,抗體覆蓋少的那部分組織和其他部分抗體的濃度是一樣的,只是抗體體積的大小差異!如果說抗體傾斜沒覆蓋好的地方是陰性,那為什么不是干片所導(dǎo)致的非特異性高背景的染色呢?當(dāng)切片傾斜到有一半甚至都沒液體時(shí), 就會(huì)出現(xiàn)陰陽臉樣的著色。你認(rèn)為呢?9?高溫抗原修復(fù)后就沒必要滅火內(nèi)源性過氧化物酶 ?經(jīng)過高溫POD已經(jīng)滅活了,不錯(cuò)POD是被被滅活了,但它仍有還原能力,仍能跟DAB發(fā)生氧化還原反應(yīng),使DAB顯色,我們用雙氧水是耗竭POD的還原能力,使之不能在跟DAB反應(yīng)。所以無論修復(fù)與否都應(yīng)該滅活 POD,盡可能消除非特異性著色。冰凍切片有時(shí)會(huì)有小洞?冰凍切片有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)切片上會(huì)有空洞,這是因?yàn)榻M織在冰凍過程中形成冰晶,形成冰晶的原因一是組織冰凍時(shí)間太慢,或者冰凍的溫度不夠低,慢慢形成冰晶,二是有些組織在冰凍之前需要做適當(dāng)?shù)墓潭ǎ缒X組織,然后放入30%的蔗糖4度冰箱過夜以減少冰晶形成,并且能最大程度保持組織細(xì)胞形態(tài)。另外在切片是組織塊復(fù)溫要在37度速融,否則易造成組織塊的破壞。常用免疫組化結(jié)果分析方法?陽性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在40*光鏡下,隨機(jī)選擇不重疊的10個(gè)視野,人工或機(jī)器計(jì)數(shù)陽性著色細(xì)胞,每組 3~6張不同動(dòng)物組織切片,然后進(jìn)行組間比較即可?;颐芏确治龇āMㄟ^在不同組別和不同動(dòng)物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用 imagej進(jìn)行灰密度分析,然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析即可。評(píng)分法。通過在光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織切片分別按染色程度( 0~3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色)、陽性范圍進(jìn)行評(píng)分(1~4分為0~25%、26~50%、51~75%、76~100%),最終可以分?jǐn)?shù)相加,再進(jìn)行比較。對(duì)于以上這幾種方法,各有利弊,請(qǐng)細(xì)心選擇。要想得到正確結(jié)果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片。DAB呈色后到底什么樣染色是特異性染色?陽性標(biāo)記可以從色度特征,陽性標(biāo)記細(xì)胞學(xué)特征來進(jìn)行基本的判斷。色度特征:一般而言,抗原含量越多,分布密度越高,標(biāo)記方法越敏感,陽性結(jié)果顯色則越強(qiáng)。根據(jù)陽性標(biāo)記的顯色程度分為:淡黃色,提示為弱抗原;棕黃色,提示為中等度抗原;棕黑色,示為強(qiáng)抗原。在結(jié)果判斷中,后兩者較有意義,可作為判斷依據(jù)。細(xì)胞學(xué)特征:陽性表達(dá)必須在細(xì)胞特定的抗原部位,若不在抗原所在部位的陽性表達(dá)即使陽性也不應(yīng)作為判斷依據(jù)。一般分為胞膜型,胞核型,胞質(zhì)型,微絨毛型,復(fù)合型幾種。這是需要結(jié)合背景知識(shí)的。同樣,非特異性染色也有一定的特點(diǎn):它首先是指抗原無明確定位,各種細(xì)胞累及一片,色度無深淺之分,這種標(biāo)記組織片不能作為免疫組織標(biāo)記結(jié)果判斷的依據(jù),造成非選民性染色的原因常為組織標(biāo)本固定不佳,抗體質(zhì)量問題或稀釋度不合理及操作方法不規(guī)范等。因此,免疫組化特異性染色定位非常重要,一般情況下,陽性細(xì)胞與陰性細(xì)胞相互交雜,陽性染色強(qiáng)度深淺不一。如果缺乏細(xì)胞音的不均一性染色,即或呈陽性染色,常提示為非特異性染色。另外,組織片邊緣反應(yīng)和出血壞死灶周圍陽笥反應(yīng)不能作為診斷依據(jù)。13.1.石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象?我用組織芯片和普通切片在多種條件下進(jìn)行了抗原修復(fù)實(shí)驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)在熱修復(fù)后,組織脫片最主要原因是組織脫水不良,腫瘤組織黏附性差在小塊組織時(shí)也容易撕脫(減小熱修復(fù)加熱功率,PBS沖中洗時(shí)不要直對(duì)組織沖洗、可以有效防范)。DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻:如一片著色,一片不著色或染色淺?這就是免疫組化染色的陰陽臉,免疫組化實(shí)驗(yàn)是環(huán)環(huán)相扣的實(shí)驗(yàn),任何一步試劑孵育不全(沒有均勻的在組織上孵育)都可能導(dǎo)致這樣的結(jié)果。免疫組化結(jié)果老是出現(xiàn)陰性結(jié)果?那就要考慮真陰性還是假陰性!假陰性是你操作不當(dāng)或者試劑質(zhì)量的問題了。切片染色后背景太深,不易區(qū)分特異性與非特異性著色?你的抗體是否特異,孵育時(shí)間溫度濃度是否過長!一抗從4度拿出后,為什么有人說要37度復(fù)溫,目的是什么?我沒遇到這樣的說法,是否是想加速復(fù)溫?還有我不知道國內(nèi)的院校為什么對(duì)37C孵育如此感興趣,在你們買國外抗體時(shí),他們的說明書上除了酶修復(fù)要37C外,其他步驟中均沒有說要在37C中孵育。免疫組化中抗原修復(fù)的最佳條件是什么?尤其微波修復(fù)??乖迯?fù)沒有什么最佳條件只有可能管用的修復(fù)條件。有人在一抗孵育前用tritonX100來通透細(xì)胞,對(duì)石蠟切片需要否?tritonX100是脂質(zhì)溶解劑,做免疫細(xì)胞化學(xué)時(shí)細(xì)胞膜是完整的半透膜,孵育的抗體要自由的通過細(xì)胞膜就要用tritonX100來破膜。石蠟切片細(xì)胞多數(shù)是切開狀態(tài)了。但是脂質(zhì)有時(shí)會(huì)吸附抗體,含脂質(zhì)高的組織也可以用triton。蘇木素復(fù)染的時(shí)間應(yīng)該是多少?復(fù)染過度咋辦?要看你是用什么蘇木素,免疫組化復(fù)染,不比我們平常的 HE,它只要一般的輕微染色就
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