重組谷氨酸脫羧酶大腸桿菌合成Y

重組谷氨酸脫羧酶大腸桿菌合成Y-氨基丁酸條件的優(yōu)化

（南京農業(yè)大學食品科技學院，江蘇南京210095）摘要:研究重組谷氨酸脫羧酶大腸桿菌合成、Y-氨基丁酸（y-aminobutyricacidGABA）的適宜條件。檢測溫度、pH值、表面活性劑、金屬離子、底物與菌體質量比以及反應體系體積對GABA轉化效率的影響。結果表明:最優(yōu)轉化條件為:轉化體系5mL、底物L-谷氨酸鈉濃度0.1mol/L、重組大腸桿菌細胞6.4mg（干質量）、Triton-100體積分數0.06%。 濃度0.6mmol/L,轉化溫度45°C、反應體系pH4.5。在該體系下反應7h,GABA合成量達到26.1g/L,GABA轉化效率在1h時達到最高，為13.8g/<g.h），較優(yōu)化前提高1.5倍。關鍵詞:Y-氨基丁酸;谷氨酸脫羧酶;轉化條件;優(yōu)化Y-氨基丁酸（y-aminobutyricacidGABA）是哺乳動物中樞神經系統(tǒng)一種主要的抑制性神經遞質。GABA具有許多重要的生理功能，如降血壓［1｝、預防癲癇［2］、抗抑郁［3］、抗疲勞［4］l、控制哮喘⑸和促進激素分泌等。山于GAGA具有諸多重要的生理功能，已經發(fā)展成為一種新型的功能性因子，正逐漸被廣泛應用于食品保健、醫(yī)藥、化工及飼料［6］等領域。目前，國內外都在積極研發(fā)富含GAGA的食品，己成功研發(fā)的有茶飲料、米胚芽、功能性飲料、乳制品和大豆發(fā)酵制品［7-9］。微生物法制備GAGA的優(yōu)點很多，如安全性較高、反應條件溫和、生產成本較低以及較好的商業(yè)化開發(fā)應用前景等，因此，近年來微生物法制備GAGA受到國內外學者廣泛的關注，其中大腸桿菌、紅曲霉、釀酒酵母、乳酸菌等GABA生產菌種研究較為深入。已有很多研究證明乳酸菌具有合成GAGA的能力［10-13］,乳酸菌作為一種有保健作用的益生菌，用其合成GAGA越來越受到人們的青睞，目前用乳酸菌合成GAGA的研究主要集中在菌株的篩選、傳統(tǒng)誘變方法以及發(fā)酵條件優(yōu)化上，但是，山于乳酸菌具有發(fā)酵周期較長以及培養(yǎng)條件較難制等缺點，在生產強度上處于劣勢，而借助基因工程手段構建高拷貝重組質粒，導入宿主菌，可以使谷氨酸脫羧酶（glutamicaciddecarboxylase，GAD）表達量提高，獲得高GAD活性的基因工程菌，從而縮短生產周期，提高生產強度。GABA對紫外、可見光及電化學都不靈敏，直接檢測GABA很困難。目前報道的有紙層析法［14］、薄層掃描法［15］氨基酸分析儀法［16］、毛細管電泳法［17］、高效液相色譜［18］及氣相色譜-質譜法［19］等，其中高效液相色譜法可定量檢測GAGA，相較氨基酸分析儀法成本低、分離時間短，是一種較為常用的方法。谷氨酸脫羧酶基因gadB來源于菌株StreptococcusthermophilusY2,將其與E.coli,表達載體pET-23a連接構建重組表達載體，轉入E.coli，獲得gadB基因工程菌E.coliBL21（DE3）-［pET-23a-gadB］［20］。利用該基因工程菌催化L-谷氨酸鈉生成GABA，通過研究溫度、pH值、表面活性劑、金屬離子、底物與菌體質量比以及反應體系體積對GABA轉化效率的影響，確定該菌株轉化合成GABA的最佳轉化條件，通過在此最佳轉化條件下合成GABA，以期提高GABA轉化效率，達到全細胞轉化法高效制備GABA的目的。1材料與方法菌種、培養(yǎng)基與試劑EscherichiacoliBL21（DE3）-［pET-23a-gadB］由南京農業(yè)大學酶工程研究室保藏。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）:胰蛋白陳10g,酵母提取物5g,NaCl10g，加水溶解后,加去離子水定容到1000mL。使用時向其中添加經過濾除菌的氨節(jié)青霉素，抗生素終質量濃度為100Ug/mL。GABA（純度》9%）、丹磺酰氯美國Sigma公司；曲拉通X-100廣東光華科技股份有限公司；四氫呋喃（色譜純）、丙酮上海凌峰化學試劑有限公司；冰乙酸（色譜純）天津市科密歐化學試劑有限公司；甲醇（色譜純）國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。儀器與設備HYG-A全溫搖瓶柜太倉實驗設備廠;AY120電子精密天平日本Shimadzu公司;隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱上海躍進醫(yī)療器械廠；手提式蒸汽壓力滅菌器上海醫(yī)用核子儀器廠；5804R高速冷凍離心機德國Eppendorf基因公司;SW-CJ-IBU超凈工作臺蘇凈集團安泰公司;Agilent1100series高效液相色譜系統(tǒng)美國安捷倫公司。方法重組大腸桿菌細胞的制備培養(yǎng)條件轉接甘油凍存菌E.coliBL21(DE3)-[pET-23a-gadB]于LB液體培養(yǎng)基中，37°C, 180r/min振蕩培養(yǎng)12-14h至對數期備用，將種子液按3%的接種量接入300mL的新鮮液體LB培養(yǎng)基中，37°C,180r/min振蕩培養(yǎng)至OD(6OOnm)=0.6~0.8，加入誘導劑異丙基硫代半乳糖苷至其終質量濃度為0.1陰/mL,16°C、180r/min誘導16h以上。菌懸液的制備將發(fā)酵液在40°C于8000Xg離心10min，棄上清液得到菌體沉淀。用9g/L的生理鹽水重懸菌體2次，按照10倍濃縮發(fā)酵液的比例加入已滅菌的生理鹽水，反復吹打制得菌懸液，加入甘油置于-20°C冰箱中保存。1.3.2重組大腸桿菌細胞合成GABA轉化條件優(yōu)化分別對轉化溫度、轉化pH值、表面活性劑處理、金屬離子處理、底物與菌體質量比、反應體系體積進行單因素優(yōu)化試驗，然后在最優(yōu)條件下測定轉化時間對GABA轉化效率的影響。以26.55mL濃度為0.1mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以3mL菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調pH值為4.5作為標準反應體系，于37°C, 180r/min的恒溫搖床反應1h,取上清液凍存待測。GABA含量的測定色譜條件[[21}5]GABA的高效液相色譜檢測條件:AgilentHC-C18柱(4.6mmX250mm, 0.5ym);進樣量:20柱溫:35°C;紫外檢測波長:254nm;流速:0.6mL/min;檢測時間:45min;流動相:A相為甲醇,B相為四氫咲喃-甲醇-0.05mol/L乙酸鈉(pH6.2，體積比5:75:420)。樣品處理及衍生化取冰箱中保存的待測樣品20"，用0.1mol/L(pH=9.8)的碳酸氫鈉緩沖液稀釋10倍，然后加入0.2mL等量的(4g/L)丹磺酰氯(1-二甲氨基-萘-5-磺酰氯，DNS-Cl)丙酮溶液，置于37°C條件下避光衍生化反應1h,DNS-Cl能與氨基酸的一級胺、二級胺、巰基、咪唑基和酚羥基縮合，生成DNS-GABA衍生物，衍生結束后過0.22卩m濾膜待測。2結果與分析2.1最適預處理溫度與時間在轉化之前，把菌體在55、60°C分別處理1.5、3、6、12、24h，并設置未加熱處理對照組。在29.55mL反應體系中，以26.55mL濃度為0.1mol/L的L-谷氨酸鈉為底物，以3mL菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調pH值為4.5，在37°C條件下反應2h,測定在不同溫度與不同時間熱處理條件下GABA轉化效率。如圖1所示，菌體經過熱處理后，GABA轉化效率明顯提高，其中效果最好為55°C處理1.5h,GABA轉化效率由3.6g/(g.h)提高到8.0g/(g.h),提高了1.2倍。55°C處理1.5~24h時GABA轉化效率均高于對照組，說明熱處理對GABA轉化效率的提高具有促進作用，原因可能是熱處理使得菌體細胞結構更加疏松，有利于與底物充分進行反應，使得GABA轉化效率提高。以55、60°C條件對菌體進行熱處理。

0「W-三處理條件閨1 桂理對風皿養(yǎng)化效車的夠詹Fig-1 Effectoflaentli-eAtmentoultheprodtictivityofGABA最逋轉化溫懐圈2 報化鼻底對品*心仙:率的巖驕Fig^2Effect?ftenLpei-fttra'if thepr?dnctivity?fGABA玄驗透取尖~葺P進行研處，/nSO.ssm匸.反應體系屮，mL濃丿龍為0.1mol./L-的E-徉氨酸鈉對底物，以3mL菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調pH值為4.,,在不同溫度下反應lh,測定在不同溫度下GABA轉化戲率。血圖7」聽示.CrA-RA轉化戰(zhàn)率陸著轉化溫恁的升高而升高"冷4U達到呈高，GABA轉化效率為6.1g；<g-h),分T?収后GkABA詁化放率隨著祐化溫咲的升局而降低口町能足因為溫度過咼使得GAD酶活性卜降，町仏GAD侏化舍成UABAfJ勺最適轉化溫度対必"C.晶活比化門口牡研究認為GAD賦予微生物細胞對酸性環(huán)境的抵抗能力，微生物在缺氧、酸性等不利條件下，GAD催化酸性谷氨酸變成屮性G-ABA,進而維持細胞處于pH值較穩(wěn)定的環(huán)境中少、實驗選取pH3.0?30進行研究，在29"mL反應體系中，以25"mL?濃度為01mol/L的Z-谷氨酸鈉為底物，以3mJ菌液為酶源，乙酸-乙酸鈉緩沖液調節(jié)不同pH值，在37°C條件下反應lh,測定在不同pH值條件下GABA轉化效率。ffi3 轅化pH值對GABA轉化效率的夠響Fig.3EffectofpHontheproductivityofGABA如圖3所zj；,GABA轉化效率隨著pH値的增加呈現先曾加厲減小的趨勢，pH(ft為4.5時GABA轉化效率達到最大，為6.25g/(g*li),可見pH4.5時GAD酶沾性最高，與己報道的微生物來源的GAD反應最適pH3.8?5.0之間口7】晝水一致。pHfft在3.0、35時，GABA轉化效率很小，可走是pH值過低抑制了GAD酶沾性及細胞的通透性，繼而彩響GABAl'l勺轉化效率。不同農而活性齊IJ對GABA轉化效率的影響表而活性劑可以增加細胞的通透性，冋時表而活性刊也可能是酌的促進劑或抑制劑。實驗選取了表而活性齊llI燈E甚稠汕箜鈉(socliiuiidodecylsxilfaterSDS)、吐7/|[31-80和Tritoi—lOO邊行處理亠對照戲丨Tri^n-l0()irhifil-KOST^S表I衍話性削4不周義面活性刑對皿B血轉化效申的形響Flg.4■Rl'IVT“I*siir-r：Kd:iidK?mllif?pr?Kliu?1ivilyoPG^ABA在2^.5521111丿:疋卜応?本系IpT 26.55iiiL］在度加O1nioVl.ri<JZ-存氨惓鈉為底物” niT；r^液.為晦浙>乙酸-乙酸鈉緩沖液調pllffi^j4.5t<\.37C條件下JQgSOmii—測止在個刈表面帖啊:.齊U處理卜-GABA轉化效率。如國4所力J吐溫壽0對GABA的合成」(冇扌6制作用，5DS嚴亟扌中制'J*GABA的合成亠liiton^1OO^GABA的合成-'I仃促進作用.岡此選耳乂Tzrit口TL-1OO作為GABAfr成促進岡了，并對其添加量辺:行?優(yōu)化。測定添加不同Triton-100添加量處理下GABA轉化效率，如圖5所示，在Triton-100體積分數小J0.02%時,GABA轉化效率隨著Triton-100?^加量的增加而升高，在Triton-100體積分數大于0.02%時GABA轉化效率增加較為緩慢井趨于穩(wěn)定，在Triton-100體積分數為0.06%時，GABA轉化效率達到最高，為12.6g/(g*h)?提|苛了1?3倍，效果顯苦，因此Triton-100^加的最適體積分數為0.00%?Triton-100休積分數/%ffl5 TritomlOO源加■對?ABA轉化效率的夠腆Kig.5HffectofTriton-100concentrationontheproductivityofGABA不同金屈離子對GABA轉化效率的彫響金居離了可能足酶活性屮心的組成部分，可以與酶螯合成絡合物以維持酶三級、四級結構及蛋白質分子構象穩(wěn)定，也可能足和底物結合催化反應有關〔呻。為了考察金屬離子對GABA轉化效率的影響，本實驗探討Mg*、Ca3+,Ba*、Mn*、Ni*、Ou*、Fe*、Co*、Zii3+xFe3+10種金屈離了對GABA轉化率的影響，這些金居離子分別來口丁-MgCh、CaCl3,BaCl3,MnCl3,NiCb、CuCl3>Fed?、CoCl：、ZnCl?、FeCl?,濃度分別選取5、50liuiiol/L。在2955mL反應體系中，以26.55mL濃度為0.1moVL的厶谷氨酸鈉為底物，以3niL液為酶源，乙酸■乙酸鈉緩沖液調pH值為4.5,在37°C條件下反應lh,測定在不I司金屬離子處理bGABA轉化效率。二三)@ggv8v9金丿隔肉門Flg.CEffectofmetaltonsonthepiotliictivlityofGABA二三)@ggv8v9金丿隔肉門Flg.CEffectofmetaltonsonthepiotliictivlityofGABA如圖6所示.1O利，金M肉了添力口MA/50iiunol/LIIJ均刈GABA的介戚A冇抑制作用，說明尚濃度的金局肉子對能對微生物細胞具冇損傷作用o金展離了添丿川雖為5nmioULIhJ?Mg2*.Co3*.Fe2*、Fe*、 對GABA的合成具有抑制作丿IJ，Mn04-.Ni*、c嚴、Nf牧寸GABA的合成有促進作用，其中6嚴、Ni*效杲明顯。在卅i物中，GAD被認為是感妥Of信兮的￡EJj調筋伴侶圭1=1,敵除CaM纟吉合區(qū)域將會導敕GAD活件的下降?并會嚴垂影I響村i物的發(fā)冇?〕.細苗gad纟吉構特彳正類似J?村i物3〕.為了研究細菌GAD受Ca3+?活是仰類似于植物GAD#測AJC尹Cu2\Ni=+3種離了添加"為低濃度時對GABA轉化效率的影響門□ 2 4 6SH)1□ 2 4 6SH)11濃劇<mrioyL)二亍芒』.-畫*手辛V9VOffl? Hi^A*的序麟Fi^.7Efffee屁ofCl?*tuidNi*'jviictiitititiuirsvii(litpi^ili.P<jtivityofGABA0A

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(■..Caz <i-u-iul/L)圖9 心亠沐庶對律5鳳Wf化般卑的夠響HTfc^lolOn1*\?n^iiliciLioiimiIlit-pi^odticlivityofGABA渕「定Ca3+.Cir1.Ni"討柯金M漓丁在不冋濃度濤加；.tIGrABA^t化散率°如圖九亂訴<l；?GABAtt化效率隨者爭種金丿刖肉亍濃丿變的坍加均呈優(yōu)培扛】h"成小趨勢，偵最:適濃度不一致.其中促進效果戢好的為匚林斗，最適灘HE>JO.t>ULtrLoVC.GABA申t彳匕效率從dOg,<g-Il)州力LI至UQ.2g/(g<i)T捉訶了53.3^：貝次ZjNi"*r山打也揪度加6irmioVLTGABA轉化效卒提高了ZEQ%；再次為Uu*,fiA占謹4度為IOmiiidl/L.GABAK ^i'.'.'j/21.8%o26域:匹庇W?與菌體網ht比亍圖一N尿豊背送亍圖一N尿豊背送酸鈉緩沖液調pnfti為4一乳Zji319反應測朮底物與菌休不刖質量比Tgaba轉化效率亠加圖"斤引…GAB基轉化效率隨著底物與苗體質量比增加昭先增丿川K；減小的趨勢*在底物與菌體質量比為51時GABA轉化效率S大*達到一號一心點〔甘“〉+因此選取51為敢達底物9菌體質量比。2.7 城応反應體泵體屜1保持丿麻物屈d：打樣】體質身:比為S-設宜反應轉化液可；同體枳：5.10.15.20.25.30、35111E,以沐度為0.1uioVL的厶谷氨酸鈉為底物，以不同體積菌液為酶源.八咳-二酸飾緩沖膠調PHfil7j4.5,在釣下反應1h,測定在不冋反陶體系體積下GABA轉化效率d如團10所加，GABA轉化效率0?著反應體系體積的增加而降低+原因肓饒是反應體系體積小時+鬧體與戰(zhàn)物W按觸機會較多*轉化效率高口當反應體系體積大于25inL時「GAEA轉化效率卜-降較為緩慢「趨外趨-「W，IAI此+選取-5m「為威適應屁體系$H1? 反應怵馬休積對OABAW^tSIt*的盛甲!Fig.lOEffectofrefictionsystemvolumeantlieprofliictivityof(jABA28也優(yōu)條*卜下反也時11'J.WGABA轉化效率的彫I恂為廠探索轉化時問XJGABA產毘和轉化效率的影響,研究1?10h不同轉化時間下GABA錢化效率和合成雖的變化.16]41216]4121086斗0—CABA：H-1 2 3 4 5 6 7S9 ]0轉化時汕/h圖11 WftB^WSBjGABA轉化效車和令處■的夠購Kig.llififleclofi-&a二lionlimeontinepiTJcluclivityandjieldofGjYBjXii「述說內去優(yōu)化試驗得山戢住反應條件爼合；LU5itlL濃度為61iiloVL的￡?存虱酸訥為庖物*W6.4nLg閨體為酶源，乙酸■乙皎詡緩沖液悶pH值人4.5*在反應體系中加入體積分數為0.06%的Tiiton-100,井力口入>JO.6nmiol/L的 在45C條件下反應101“ill罔11可知TGAEA轉化效率隨若轉化吋間的增加而減卜1—4liTGABAft<B效率下降較為II小4-IO1ltGABA$t化效率下隆較為緩慢+ 111111GABA轉化效率愎離.達至1J13.8g/<g*li)?優(yōu)化前G血EA轉化效率為g/(g-li),優(yōu)化后使得GABA：?t化效率提I冃1.5們,優(yōu)化效果較好。GAEA合成址隨著反應時問的增加呈先增加姑減4、趨勢+GABA合成量在lh時噌丿川最多+達j；iJ16.0g/L.1—711CtABA合成坦緩慢增加?反應吋間為7h時GABA合成最最高，7^126.1g/L,71iW；uGABA^成邑緩慢減小T可能足rh」：隨若反隔I時問的增加’底物和菌體均會減少，而產物GABA.W漸枳累.反應…亢時h'JJi7.底物被消耗兄<■+」L產物GABA被應應休泵小杲些物幀消木J從而導gCGABA合成量的減小*3結論水研究利川實驗室保誡的圉株&coltBL21〔DE"-[pET-23a-gadB]?行傘細胞轉化,該菌棵足高效吏込6D的基因I：稈菌?木閑株打破了汛峻閑野生閑株GAD木底表達呈不局所導致的全細胞轉化效率不局的限制，借助大腸村菌GAD衣達具有口J人工調控、生長迅速以及易于高密度培養(yǎng)等頗多優(yōu)點，迖到高效率生產GAE典的目的，木實輪對車aI.?谷氨酸脫找酶細胞牛.物合成GABA轉化條件進行了優(yōu)化，最終得到最佳轉化條件為：以5inL濃度為O1moVL的，谷氨酸鈉為底物+U,6.4ing?體為酚源，乙酸■乙酸鈉緩沖液調pH值為洛一5*在反應體系中力口入體積分數>^0.06%的T工讓on-106并加入濃度為0.6rumol/L的Ca3+T在斗59條件下反應711,GABA合成暈達到201g/L.上期等[網利用工程菌粗酶液以厶谷氨酸鈉為底物催化合成GABA,GA13A牛.成量達到1957g/L+木實驗所得到的GABA生成革略高丁此研究*GAEA轉化效率在lh時込劍最f>J13.8g/(g*li)T優(yōu)化前GAEA轉化效率為5.6g/(g*li)’優(yōu)化后使得GABA轉化效率提高1.5倍，優(yōu)化條件中pH值對GAEA轉化效率影響姣丿「蟲此控制底物轉化液pii{ftU>v關鍵*piHftHi'；；j或過低均?不利JOABA的生成.岡pH侑過r，'；]或過低均公影響酶活件"此外「港加低濃度的表面活件劑Triton-100X+GABA4t化效率的捉M效呆兄菩+最佳添丿川機…為0.06%+GABA軼化效率較對照釘L提島1.3倍+迄1」J陡是岡九Tilton-10010加了細胞膜的通透性，使得底物更易進入細胞內辿行反血1而產物GABA更易透過細胞腆邊入細咆外*木實驗才-?？疾炝藛?岡素對GABAH化效率的影響+未對因素間的交互杵用做川研究,還仃待進一步探素。田靈芝等⑴」利用重組谷氨酸脫按酶大腸秤菌合成GABA＞在最優(yōu)條件下，批次添加底物，谷氨酸共600g,5L發(fā)酵維轉化24h,GABA累計質早濃度高達204.5g/L,以，物質的雖計、轉化率為97.92%,說明用發(fā)酵罐生產GABA的產量很高，岡此木課題組下一步研丸將在發(fā)酵罐的水平上進行.參垮文獻：S2IIMADAM.ILASB3AWAT.NISHIMURAC.ctnlAntihypertensiveeffectof^-amLncibutyi^icacidG-ABAi-richchlorellaonhighnormalbloodpressureandbcrderlinenypertensioninpInc-cC3iiLrC311rclclcy.iblrbliner.ELudy^J]Clinicnlme!F.xprriinraiLnlII沁wiEwicn”20W^：i4■■--^2.-\_-jS4COSS^XRTR.EERITARDC.EHLTAKEY.MultiplefacetsofCrAEArrgiclicLU'oiiiicniclsyn^DKCE.]iiulli]jlrfclcsofGABAKis^LialliiiE^incpilnpsics[.lJ'I'rrndsinb-TmiroGGin-iccs./：,：)()S,28(27108-11OK.-YDAT.SUC?：SHITAT.:T.etcil.Effectofrhectrfnittelrice蘭匕門口^iikUiclIv/ithCtABAfcr藝匕 3pi=aiicjii-nutonon?icrlisoiTlnrbynrn：nrlinii-iis"iTition[J]N：ppm-iSlinkii：-iinKqgolTLiKagail^uKaichi.2000.彳7(3itO3.楊帆，金迪，蔡東聯，等.卩-氮基丁釀茶對小鼠抗疲勞作用的研允[叮.氨呈酸和粧物査噸.3311,33(2):60-63孫日雯，祝晉芳，馮源.嚴氨基丁酸巧哮喘的關霖[丁].中國醫(yī)藥指南,2010i3I.40-42.[切州原濰.鄒曉庭.新型綠色詢料戀加劑：尸爲皐廠酸[丁].畜牧弓洋醫(yī).200^,d1,A,號-100[?]周小理.趙琳丁-氨基丁酸的心理功能堆rr肚晶」應川的研究進展[門.食品r^lk,3Q11,32(10):58-el[S]工輝，頂麗麗，張擁華丁-氨亙丁釀「GABA、的功能性及1V?仗島中的應川【丁1食鬲丨[A2D1&只斗宀)：13&-18^[匚]IIAYAKAWAK7K：LTUKAM.KIASAllAK.ntnlInfectofr\-ammatn-Ttyi'lcscicenrichccdairyproductonthebloodpressureofspoutoilecuslyliyi^crtcnsi'/candnermstcns1vc'A^'istor-Kyotorats[JJ.BritLshJoLTnalofMuti'EiQn.2004.^2(3i：411-斗17.匸1￡ISISJ.KIMJ5.KAITOYM.etalAiiticxiclaiitactivityancl■)-cutl1nobi.ityricncid(OA13A)contci'tinseatnnglufcimcntecltryLadobaGilh^brevisBJ'20lEolalcYlI'ron;Irsdil^GiialI'n'iiLtiiLtclL'oocfelJJ.上ocxlCLicklisti-y.2OLO.132j1i.271276.LIHuizin^.GAGD:uidLtti.CAOYusditziy.匕I:il.AtiLyiiy-LLiiinobjlyicL.cjidpiodLLcingLactohacillusbrevisiuolLittJ1romCIkii1vrict1icziri1])ric):;rii；J]Atitifi1.-^ol'T/Ticnobic)1cigy.200S,^Sid)：汐1門6S3劃婷婷.高產丁-氨皋丁酸乳酸調誦株選育及我轉化舐件優(yōu)化[D].無?iT.frJA學，201門1匚-力仇婷.短乳村菌NCL912連續(xù)培養(yǎng)生產片氨基J酸研H[DJ.南昌南昌大學,2011:12.曾小群，盛姣鈴.潘道東，等.新疆酸馬奶中產丁-氨基丁酸乳酸菌的篩選與鑒定[J]中國倉品學報.2013.13(10):101-1%黃美娥.彭勝.陳陽波.南瓜葉中丁-氨基J?酸的捉取及薄層打描測定[耳尺然產物硏究與開發(fā),2012,24(9)1284-12S7.夏虹.彭茂民，周有祥.發(fā)芽米中?-氨基丁酸含量的測定[:T].仗品號機械.2009.25(4):100-102.張慶慶，劉輝，湯斌.等?柱前衍生化毛細管電泳法測定紅曲酒中嚴氨基丁酸含呈[丁].優(yōu)品與發(fā)酵工業(yè),208.35|12):119-122.[13]李遂勤.王立忠，彭海成反相高效液相色譜法測定倉品中嚴氨基J'酸的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗朵志,2011.21(9):2179-2130BUCKK.VOEHRITTGERP.FERGERE.R申idancil廬isofGABAandglutcunateinmicrodialysissamplesusinghighperformanceliquidchi^omatographyandtandemmassspectrometiy[J]JournalofNeuroscienceMethods?2009,132(1):78-84.LINQ,YAITOSY?L