單克隆抗體的制備7

概要第一代抗體：多克隆抗體第二代抗體：?jiǎn)慰寺】贵w第三代抗體：基因工程抗體請(qǐng)簡(jiǎn)述多克隆制備過程。

采用的是把某種抗原反復(fù)注射到動(dòng)物體內(nèi)，然后從動(dòng)物血清中分離出所需抗體的方法。此類抗體作為診斷試劑有何缺點(diǎn)？產(chǎn)量低、特異性差、純度低，反應(yīng)不夠靈敏。為克服多抗的缺點(diǎn)，可用什么物質(zhì)替代？單克隆抗體。BBBBAgAgAgAg傳統(tǒng)免疫學(xué)清制備機(jī)制人體人體第四章單克隆抗體制備鄧念華臨床微免教研室表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗體單克隆抗體請(qǐng)問單抗和多抗的區(qū)別與聯(lián)系。英文全稱：monoclonalantibody,McAb定義：每一克隆B細(xì)胞所產(chǎn)生的理化性狀高度均一、組成均一、只與同一種抗原決定族反應(yīng)的抗體。BBBBAgAgAgAg用傳統(tǒng)方法能否制備單克隆抗體？人體人體你有何新策略？單克隆抗體制備思路：BBBBAgAgAgAg體內(nèi)B體外BBBB？體外B體外癌細(xì)胞癌細(xì)胞B體外既可增殖又可產(chǎn)生抗體HybridomaTechnologyHybridomaTechnologyandProductionofMonoclonalAntibodies

-Monoclonalantibodiescanbeproducedinspecializedcellsthroughatechniquenowpopularlyknownashybridomatechnology.Thistechnologywasdiscoveredin1975bytwoscientists,GeorgesKohlerofWestGermanyandCesalMilsteinofArgentina,whojointlywithNielsJerneofDenmarkwereawardedthe1984Nobel,PrizeforPhysiologyandMedicine.

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1984

"fortheoriesconcerningthespecificityindevelopmentandcontroloftheimmunesystemandthediscoveryoftheprincipleforproductionofmonoclonalantibodies"NielsK.JerneGeorgesJ.F.K?hlerCésarMilstein1/3oftheprize1/3oftheprize1/3oftheprize漿細(xì)胞(B)篩選瘤細(xì)胞一)雜交瘤技術(shù)1、親本細(xì)胞的選擇2、細(xì)胞融合3、雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞Hybridcell一、雜交瘤技術(shù)的基本原理融合多種細(xì)胞

1.親本細(xì)胞的選擇

1)小鼠骨髓瘤細(xì)胞

a.穩(wěn)定，易培養(yǎng)；b.它是B細(xì)胞惡性腫瘤，與脾細(xì)胞同源，融合率高；c.能與細(xì)胞雜交形成穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞，并分泌免疫球蛋白；d.本身不分泌免疫球蛋白；e.次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(TK)缺陷的細(xì)胞株(？)；

1.親本細(xì)胞的選擇

1)小鼠骨髓瘤細(xì)胞

2)免疫脾細(xì)胞

經(jīng)抗原免疫的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞，具有分泌抗體的能力。動(dòng)物：BALB/c小鼠7～12周齡20g～25g體重B癌細(xì)胞BBB癌細(xì)胞B癌細(xì)胞癌細(xì)胞癌細(xì)胞體外癌細(xì)胞B癌細(xì)胞自然選擇融合劑

2.細(xì)胞融合如何才能得到雜交瘤細(xì)胞？細(xì)胞融合劑：PEG:一般把分子量1000、1500、4000的PEG是最常用的細(xì)胞融合劑作用機(jī)理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開而有助于細(xì)胞融合作用特點(diǎn)：隨機(jī)發(fā)生的，不同廠商、批號(hào)、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同DNARNA小分子化合物經(jīng)典途徑補(bǔ)償途徑次黃嘌呤(Hypoxanthine)胸腺嘧啶核苷(Thymidine)TKHGPRT葉酸氨基蝶呤(Amniopterin)

DNA合成的途徑：

3.雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)HAT培養(yǎng)基：

Hypoxanthine

次黃嘌呤

Amniopterin氨基蝶呤

Thymidine胸腺嘧啶核苷

骨髓瘤細(xì)胞（HGPRT-,TK-）：不能生長雜交瘤細(xì)胞（HGPRT+,TK+）：能夠生長該培養(yǎng)基中細(xì)胞不能利用經(jīng)典途徑只能利用補(bǔ)償途徑合成DNA。一、雜交瘤技術(shù)的基本原理B細(xì)胞B細(xì)胞B細(xì)胞AgB細(xì)胞B細(xì)胞B細(xì)胞瘤細(xì)胞B細(xì)胞瘤細(xì)胞B細(xì)胞瘤細(xì)胞B細(xì)胞瘤細(xì)胞B細(xì)胞瘤細(xì)胞B細(xì)胞瘤細(xì)胞二)陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化與凍存1、陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化有限稀釋法(limitingdilution)

顯微操作法(micromanipulation)FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）軟瓊脂平板法(softagarmethod)有限稀釋法計(jì)數(shù)103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔特點(diǎn)：不需任何特殊設(shè)備；克隆出現(xiàn)效率高；實(shí)驗(yàn)室常用方法。效率最高價(jià)格昂貴FACS2、細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇配制方案：雜交瘤細(xì)胞（（1～5）x106/ml)+細(xì)胞凍存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO)“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇防止污染避免染色體丟失防止非分泌細(xì)胞的過度生長防止細(xì)胞密度過高而死亡細(xì)胞冷凍的意義抗原致敏淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞融合選擇性培養(yǎng)抗體分泌細(xì)胞篩選克隆化單抗制取單抗純化單抗鑒定三、雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體流程細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞復(fù)蘇抗原提純和動(dòng)物免疫細(xì)胞融合PEG雜交瘤細(xì)胞篩選HAT陽性克隆化（反復(fù)3-5次）單抗的純化及鑒定

克隆擴(kuò)大生產(chǎn)

制取脾細(xì)胞懸液

ELISA檢測(cè)抗體抗體檢測(cè)收集骨髓瘤細(xì)胞加飼養(yǎng)細(xì)胞收集抗體上清

一)、抗原的提純與動(dòng)物免疫

1、抗原：純度越高越好。細(xì)胞抗原：10×107個(gè)細(xì)胞作腹腔免疫?？扇苄钥乖号c佐劑配合使用。

2、動(dòng)物選擇：選擇BALB/c健康小鼠，8-12周，雌雄不限；同時(shí)免疫3-4只小鼠。3、免疫方法：同多克隆抗體。一)、抗原的提純與動(dòng)物免疫

3、免疫方法：細(xì)胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐劑，2~3周重復(fù)一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原;3~6周100~200微克抗原;融合前3天，加強(qiáng)免疫;末次免疫后，分離脾細(xì)胞。二)、骨髓瘤細(xì)胞的制備各種骨髓瘤細(xì)胞株圴可，但應(yīng)用最多的是Sp2/0細(xì)胞株。選擇對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)：渾圓、透亮、均一、排列整齊避免細(xì)胞返祖：定期用8-AG處理細(xì)胞注意事項(xiàng)：切忌過多傳代培養(yǎng)，可將細(xì)胞分裝凍存于-80℃或液氮及干冰中三)、飼養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞密度過低不利