單克隆抗體的制備7

概要第一代抗體：多克隆抗體第二代抗體：單克隆抗體第三代抗體：基因工程抗體請簡述多克隆制備過程。

采用的是把某種抗原反復(fù)注射到動物體內(nèi)，然后從動物血清中分離出所需抗體的方法。此類抗體作為診斷試劑有何缺點？產(chǎn)量低、特異性差、純度低，反應(yīng)不夠靈敏。為克服多抗的缺點，可用什么物質(zhì)替代？單克隆抗體。BBBBAgAgAgAg傳統(tǒng)免疫學(xué)清制備機制人體人體第四章單克隆抗體制備鄧念華臨床微免教研室表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗體單克隆抗體請問單抗和多抗的區(qū)別與聯(lián)系。英文全稱：monoclonalantibody,McAb定義：每一克隆B細(xì)胞所產(chǎn)生的理化性狀高度均一、組成均一、只與同一種抗原決定族反應(yīng)的抗體。BBBBAgAgAgAg用傳統(tǒng)方法能否制備單克隆抗體？人體人體你有何新策略？單克隆抗體制備思路：BBBBAgAgAgAg體內(nèi)B體外BBBB？體外B體外癌細(xì)胞癌細(xì)胞B體外既可增殖又可產(chǎn)生抗體HybridomaTechnologyHybridomaTechnologyandProductionofMonoclonalAntibodies

-Monoclonalantibodiescanbeproducedinspecializedcellsthroughatechniquenowpopularlyknownashybridomatechnology.Thistechnologywasdiscoveredin1975bytwoscientists,GeorgesKohlerofWestGermanyandCesalMilsteinofArgentina,whojointlywithNielsJerneofDenmarkwereawardedthe1984Nobel,PrizeforPhysiologyandMedicine.

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1984

"fortheoriesconcerningthespecificityindevelopmentandcontroloftheimmunesystemandthediscoveryoftheprincipleforproductionofmonoclonalantibodies"NielsK.JerneGeorgesJ.F.K?hlerCésarMilstein1/3oftheprize1/3oftheprize1/3oftheprize漿細(xì)胞(B)篩選瘤細(xì)胞一)雜交瘤技術(shù)1、親本細(xì)胞的選擇2、細(xì)胞融合3、雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞Hybridcell一、雜交瘤技術(shù)的基本原理融合多種細(xì)胞

1.親本細(xì)胞的選擇

1)小鼠骨髓瘤細(xì)胞

a.穩(wěn)定，易培養(yǎng)；b.它是B細(xì)胞惡性腫瘤，與脾細(xì)胞同源，融合率高；c.能與細(xì)胞雜交形成穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞，并分泌免疫球蛋白；d.本身不分泌免疫球蛋白；e.次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(TK)缺陷的細(xì)胞株(？)；

1.親本細(xì)胞的選擇

1)小鼠骨髓瘤細(xì)胞

2)免疫脾細(xì)胞

經(jīng)抗原免疫的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞，具有分泌抗體的能力。動物：BALB/c小鼠7～12周齡20g～25g體重B癌細(xì)胞BBB癌細(xì)胞B癌細(xì)胞癌細(xì)胞癌細(xì)胞體外癌細(xì)胞B癌細(xì)胞自然選擇融合劑

2.細(xì)胞融合如何才能得到雜交瘤細(xì)胞？細(xì)胞融合劑：PEG:一般把分子量1000、1500、4000的PEG是最常用的細(xì)胞融合劑作用機理：誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開而有助于細(xì)胞融合作用特點：隨機發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同DNARNA小分子化合物經(jīng)典途徑補償途徑次黃嘌呤(Hypoxanthine)胸腺嘧啶核苷(Thymidine)TKHGPRT葉酸氨基蝶呤(Amniopterin)

DNA合成的途徑：

3.雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)HAT培養(yǎng)基：

Hypoxanthine

次黃嘌呤

Amniopterin氨基蝶呤

Thymidine胸腺嘧啶核苷

骨髓瘤細(xì)胞（HGPRT-,TK-）：不能生長雜交瘤細(xì)胞（HGPRT+,TK+）：能夠生長該培養(yǎng)基中細(xì)胞不能利用經(jīng)典途徑只能利用補償途徑合成DNA。一、雜交瘤技術(shù)的基本原理B細(xì)胞B細(xì)胞B細(xì)胞AgB細(xì)胞B細(xì)胞B細(xì)胞瘤細(xì)胞B細(xì)胞瘤細(xì)胞B細(xì)胞瘤細(xì)胞B細(xì)胞瘤細(xì)胞B細(xì)胞瘤細(xì)胞B細(xì)胞瘤細(xì)胞二)陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化與凍存1、陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化有限稀釋法(limitingdilution)

顯微操作法(micromanipulation)FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）軟瓊脂平板法(softagarmethod)有限稀釋法計數(shù)103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔特點：不需任何特殊設(shè)備；克隆出現(xiàn)效率高；實驗室常用方法。效率最高價格昂貴FACS2、細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇配制方案：雜交瘤細(xì)胞（（1～5）x106/ml)+細(xì)胞凍存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO)“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復(fù)蘇防止污染避免染色體丟失防止非分泌細(xì)胞的過度生長防止細(xì)胞密度過高而死亡細(xì)胞冷凍的意義抗原致敏淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞融合選擇性培養(yǎng)抗體分泌細(xì)胞篩選克隆化單抗制取單抗純化單抗鑒定三、雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體流程細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞復(fù)蘇抗原提純和動物免疫細(xì)胞融合PEG雜交瘤細(xì)胞篩選HAT陽性克隆化（反復(fù)3-5次）單抗的純化及鑒定

克隆擴大生產(chǎn)

制取脾細(xì)胞懸液

ELISA檢測抗體抗體檢測收集骨髓瘤細(xì)胞加飼養(yǎng)細(xì)胞收集抗體上清

一)、抗原的提純與動物免疫

1、抗原：純度越高越好。細(xì)胞抗原：10×107個細(xì)胞作腹腔免疫?？扇苄钥乖号c佐劑配合使用。

2、動物選擇：選擇BALB/c健康小鼠，8-12周，雌雄不限；同時免疫3-4只小鼠。3、免疫方法：同多克隆抗體。一)、抗原的提純與動物免疫

3、免疫方法：細(xì)胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐劑，2~3周重復(fù)一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原;3~6周100~200微克抗原;融合前3天，加強免疫;末次免疫后，分離脾細(xì)胞。二)、骨髓瘤細(xì)胞的制備各種骨髓瘤細(xì)胞株圴可，但應(yīng)用最多的是Sp2/0細(xì)胞株。選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)：渾圓、透亮、均一、排列整齊避免細(xì)胞返祖：定期用8-AG處理細(xì)胞注意事項：切忌過多傳代培養(yǎng)，可將細(xì)胞分裝凍存于-80℃或液氮及干冰中三)、飼養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞密度過低不利