實(shí)驗(yàn)2電泳技術(shù)

實(shí)驗(yàn)二電泳技術(shù)電泳的基本原理帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象，稱(chēng)為電泳。帶正電荷的粒子向負(fù)極移動(dòng)，帶負(fù)電荷的粒子向正極移動(dòng)。是生化與分子生物學(xué)的重要研究方法之一，可用于樣品分離、物質(zhì)純度分析和分子量的測(cè)定等。一.定義帶有電荷的生物分子在電場(chǎng)作用下可發(fā)生移動(dòng)。由于混合物各組分所帶電荷性質(zhì)、數(shù)量以及分子量各不相同，在同一電場(chǎng)作用下，各組分的泳動(dòng)方向和速度也各有差異，所以在一定時(shí)間內(nèi)，它們移動(dòng)距離不同，從而可達(dá)到分離鑒定的目的。二.基本原理在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類(lèi)和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶?chǎng)中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理。

-+二、泳動(dòng)度設(shè)一帶電粒子在電場(chǎng)中所受的力為F，則F=QE（Q為粒子所帶電荷，E為電場(chǎng)強(qiáng)度）根據(jù)Stoke定律，一球形分子在溶液中運(yùn)動(dòng)所受的阻力F’為：F’=6πrηv（v為分子移動(dòng)速度；r為分子半徑；η為介質(zhì)黏度）

當(dāng)分子達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，F(xiàn)=F’即QE=6πrηv移項(xiàng)得v/E=Q/6πrηv/E表示單位電場(chǎng)強(qiáng)度時(shí)粒子運(yùn)動(dòng)速度，稱(chēng)為遷移率，也稱(chēng)電泳速度，以表示。因此上式也可表示為：=Q/6πrη

從上式可得到以下結(jié)論帶電粒子在電場(chǎng)中的移動(dòng)與:粒子大小有關(guān)，顆粒直徑愈小愈快粒子的電荷有關(guān)，電荷愈多愈快粒子的形狀有關(guān)，愈接近球形愈快三、影響遷移率的因素1.電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度是指每厘米的電位降凝膠兩端距離20厘米，電壓降200伏特，電場(chǎng)強(qiáng)度為10伏特/厘米電場(chǎng)強(qiáng)度越高電泳速度越快2.溶液的PH值PH值決定帶電顆粒的解離程度，決定物質(zhì)所帶凈電荷的多少3.溶液的離子強(qiáng)度緩沖液的離子強(qiáng)度越高，電泳速度越慢一般在0.02-0.24.電滲現(xiàn)象在電場(chǎng)中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)紙或纖維素帶負(fù)電荷，使其接觸的水溶液帶正電荷，向負(fù)極移動(dòng)。應(yīng)盡量避免選用有電滲作用的支持物四、電泳的分類(lèi)按電泳的原理來(lái)分，可分為二類(lèi)：自由界面電泳：又稱(chēng)移動(dòng)界面電泳，是指在沒(méi)有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價(jià)格昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于推廣應(yīng)用。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過(guò)程中的對(duì)流和擴(kuò)散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類(lèi)型。支持物物理性質(zhì):濾紙及其他纖維素薄膜電泳、凝膠電泳、粉末電泳、線(xiàn)絲電泳支持物裝置形式分類(lèi)：平板式電泳、垂直板式電泳、連續(xù)電泳、圓盤(pán)電泳按pH的連續(xù)性分類(lèi)：連續(xù)pH電泳、非連續(xù)pH電泳瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)瓊脂糖凝膠電泳特點(diǎn)1.具有大量微孔2.具有較高的機(jī)械強(qiáng)度可以在1%或更低濃度下使用3.無(wú)毒，不需要催化劑4.具有熱可逆性，低熔點(diǎn)瓊脂糖回收樣品容易5.生物中性，與別的生物材料結(jié)合性低6.具有高靈敏度放射自顯影7.膠凝溫度34-43℃熔化溫度75-90℃低熔點(diǎn)瓊脂糖膠凝溫度低于30℃(融化溫度高于30℃)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acry-lamide，簡(jiǎn)稱(chēng)Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，簡(jiǎn)稱(chēng)Bis）在催化劑作用下合成的。

一、概述CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺優(yōu)點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)pH和溫度變化小，沒(méi)有吸附和電滲作用小的特點(diǎn)，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。分類(lèi)聚丙烯酰胺凝膠電泳按原理和操作形式的不同，主要有不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳和雙向電泳等類(lèi)型。二、聚丙烯酰胺凝膠的制備聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：

1.化學(xué)聚合化學(xué)聚合的催化劑通常采用過(guò)硫酸銨（ammoniumpersulfate，Ap），此外還需要加速劑TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的加入，可使過(guò)硫酸銨形成自由基：S2O82-2SO4-這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交聯(lián)反應(yīng)，形成有一定平均孔徑的聚丙烯酰胺凝膠。.

光聚合通常用核黃素為催化劑，核黃素經(jīng)光照形成無(wú)色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。TEMED的存在，可以加速聚合。上述聚合反應(yīng)受許多因素的影響：（1）大氣氧能淬滅自由基，阻止多聚體鏈長(zhǎng)的增加。在進(jìn)行化學(xué)聚合前，一般用減壓抽氣的辦法除去溶液中溶解的空氣。在膠液表面，往往覆蓋一層水或溶液，隔絕空氣，可加速聚合。（2）低溫、低pH都會(huì)減慢聚合反應(yīng)速度。（3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有機(jī)玻璃，一些金屬等可抑制聚合反應(yīng)。2.光聚合不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)不連續(xù)性表現(xiàn)在以下方面：1.凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。2.緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液，而分離膠為pH8.8的Tris-HCl緩沖液。3.在電場(chǎng)中形成不連續(xù)的電位梯度。在這樣一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。8.38.38.86.71.不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠電泳儲(chǔ)備液：丙烯酰胺（30%）

14.55克丙烯酰胺，0.45克甲叉丙烯酰胺，雙蒸水溶解，稀釋到50ml,棕色瓶?jī)?chǔ)存。濃縮膠緩沖液0.5M/LTris-HCl,pH6.8分離膠緩沖液1.5M/LTris-HCl,pH8.8

電極緩沖液

0.025M/LTris，0.2M/L甘氨酸，pH8.3樣品緩沖液

0.1M/LTris-HClpH6.82ml87%甘油1ml溴酚藍(lán)1mg雙蒸水加到10ml樣品和緩沖液同煮沸，離心，上清加入樣品孔2.SDS十二烷基磺酸鈉（SDS）的作用

SDS：陰離子表面活性劑，能夠使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到蛋白質(zhì)上（結(jié)合比為1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)）使各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物都帶有相同密度的負(fù)電荷，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而掩蓋了不同種類(lèi)蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。此時(shí)蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于其分子量大小。可以利用SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)加入巰基乙醇（強(qiáng)還原劑），使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵保持還原狀態(tài)，利于蛋白質(zhì)和SDS定量結(jié)合。等點(diǎn)聚焦1.用兩性電解質(zhì)建立電場(chǎng)中連續(xù)線(xiàn)性pH梯度2.只適用于兩性解離的物質(zhì)電泳pH1018642pI雙向電泳