基因轉錄表達調控

第三章基因轉錄表達調控現代分子生物學FrancisCrick在1958年提出中心法則，指出信息傳遞是單向過程，一旦轉變?yōu)榈鞍踪|，就不會從蛋白質轉回到核酸分子，但遺傳信息可以從核酸到核酸或從核酸到蛋白質.遺傳信息從DNA經過RNA傳遞到蛋白質的過程稱為基因表達（geneexpression）。任何能較為直接影響轉錄和翻譯過程開啟/關閉及發(fā)生速率的因素及其作用過程，稱為基因表達調控(regulationofgeneexpression)?？梢栽诙鄬哟位蛩缴线M行，如轉錄起始，轉錄延伸，轉錄終止及翻譯前/后等，但最主要也是最有效的調控是轉錄起始調控。第三章基因轉錄表達調控轉錄過程與DNA復制過程非常相似，都會在特定酶的催化下合成一條與DNA摸板互補的新核苷酸鏈，但有以下區(qū)別：1）轉錄過程產生的新鏈由核糖核苷酸組成，而復制產生的新鏈則是由脫氧核糖核苷酸組成；2）催化合成RNA的聚合酶不需要引物，可以從頭（denovo）起始轉錄.在細胞內轉錄是從一段特定的DNA序列起始并轉錄某一特定的DNA區(qū)段。3）產生的RNA產物并不與模板DNA保持大范圍堿基配對，而是僅僅在酶活性中心部位保持一段8個核苷酸的互補區(qū)，已經合成的其它區(qū)段被從DNA模板上置換出來。既可以保證翻譯的同時進行，也可以允許一個基因同時被幾個聚合酶所轉錄，從而保證短時間內產生大量轉錄產物。4）精確率低于復制過程（10-4Vs10-8）第一節(jié)轉錄一、RNA聚合酶

JHarowitz與SWeiss分別在1960年首次發(fā)現以DNA為模板的RNA聚合酶，可催化如下反應：

原核生物一般只有一種RNA聚合酶，而真核生物有三種RNA聚合酶（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）。其中細菌RNA聚合酶核心酶由5個亞基組成（ββ’α’α’’ω），可以與另外六個其它亞基形成全酶（holoenzyme）,其中的σ亞基介導RNA聚合酶只對特定的啟動子序列結合并起始轉錄。真核生物的核心酶由Rpb1,2,3,11,6組成，分別對應于細菌聚合酶的β’βα’α’’ω亞基，與另外7個其它亞基組成全酶。真核生物RNA聚合酶對啟動子序列的特異性識別結合是由普通轉錄因子（generaltranscriptionfactor,GTF）介導的。.DNA模板，Mg2+/Mn2+RNAPolRNA+4nPPinNTPT.aquaticsS.cerevisiae晶體結構顯示兩種核心酶的整體結構非常相似，呈蟹爪狀（crabclaw）ThesubunitsofRNApolymerases

ProkaryoticBacteriaArcheaEukaryoticRNAP1RNAPⅡRNAPⅢβ’βα’α’’ωA’/A’’BDLK[+6others]RPA1RPA2RPC5RPC9RPB6RPB1RPB2RPB3RPB11RPB6RPC1RPC2RPC5RPC9RPB9[+9others][+7others][+11others]Channelsintoandoutoftheopencomplex二、轉錄過程整個轉錄過程可以分為三個階段：1）轉錄起始(initiation)；2）轉錄延伸(elongation)；3）轉錄終止(termination)1）DNA中一段特定序列（啟動子）被RNA聚合酶所結合，形成一個閉合復合物（closedcomplex）；閉合復合物或在其它蛋白質因子作用下,或自發(fā)地發(fā)生結構改變，形成一開放復合物（opencomplex），此過程為不可逆過程，不需要ATP水解；在開放復合物中,一段圍繞轉錄起始點約14bp（+3～-11）的區(qū)段發(fā)生解鏈，形成“轉錄泡（transcriptionbubble）”結構。相應于最初的兩個核苷酸隨后進入酶活性位點，被催化形成磷酸二酯鍵并繼續(xù)進行其它核苷酸的合成。在RNA鏈最初10個核苷酸的合成中，RNA聚合酶易從模板鏈上脫落，合成效率較低,此階段稱為流產轉錄(abortivetrancription)；一旦合成的RNA鏈長度>10nt,聚合酶可以與DNA、RNA形成穩(wěn)定的三維復合結構，進入轉錄延伸階段，這一轉變過程稱為啟動子逃離（promoterescape）.①啟動子原核生物核心酶理論上可以識別結合DNA分子上的任何一個位點;但在細胞內只會從特定啟動子序列起始轉錄。這種特異性是通過可以對啟動子序列特異性識別結合的σ因子來完成。在大腸桿菌中最主要的σ因子為σ70。被σ70識別的啟動子具有下面特點：1）具有兩段保守序列，序列中心點分別距轉錄起始點為10bp及35bp，稱為-10區(qū)及-35區(qū)；2）通過比較各種被σ70識別的啟動子序列發(fā)現，不同啟動子-10區(qū)及-35區(qū)序列非常相似，存在一個共有序列（concensussequence），其中-10區(qū)序列為TATAA

T,-35區(qū)序列為TTGACA;3)兩個保守區(qū)的間隔距離為17-19bp.ThephasesoftranscriptioncyclePromoterconsensussequenceandspacingconsensusσandαsubunitsrecruitRNApolymerasecoreenzymetothepromoter

2)當RNA聚合酶成功脫離啟動子后，進入轉錄延伸階段（transcriptionelongation）.未轉錄的DNA雙鏈從兩蟹爪交接處進入聚合酶,并分別進入酶分子中各自通道,在離開聚合酶后又重新恢復雙鏈結構.轉錄延伸中的RNA分子只有8～9nt與模板DNA互補,其余的RNA鏈則從模板鏈上剝離,并通過RNA通道離開RNA聚合酶.在延伸過程中,RNA聚合酶具有兩種校正功能:第一種為焦磷酸裂解編輯反應(pyrophosphorolyticediting),通過重新加合一個焦磷酸基團使錯誤合成的核苷酸得以釋放;另一種稱為水解編輯(hydrolyticediting),在一種Cre蛋白的協(xié)助下,聚合酶可以從錯誤加合核苷酸處后退一個或幾個核苷酸,從而使RNA3’OH端離開活性中心而被切割,后退的聚合酶則利用重新位于活性中心的3’OH進行延伸.3)當轉錄進行到特定序列時,聚合酶會從DNA模板上脫落并使RNA鏈得以釋放,這種使轉錄發(fā)生停止的特定DNA序列稱為終止子序列(terminator).終止子序列可以分為兩類:①Rho因子非依賴型;②Rho因子依賴型.第一類終止子終止轉錄不需其它蛋白因子參與,而第二類則需要Rho蛋白.Rho非依賴型終止子含有兩段特征性序列元素,第一段為長度20bp的倒轉重復序列;第二段為緊隨其后的富含A:T區(qū)(7-8對).終止子本身對轉錄無任何影響,只有在其被聚合酶轉錄后會造成轉錄終止.被轉錄的倒轉重復序列區(qū)段可以通過自身堿基配對形成發(fā)夾結構(Hairpin),可以對轉錄三維復合物產生一種張力而容易引起復合物的解體;當此種莖環(huán)結構與富含A:U區(qū)相鄰時,由于A:U配對間較弱的作用力,可以最終促使上游形成的莖環(huán)結構使轉錄復合物解體而終止轉錄.Sequenceofarho-independentterminatorTranscirptionterminationRho依賴型終止子沒有明顯的序列特征,轉錄終止的完成依賴于Rho蛋白.Rho蛋白以六聚體形式形成一環(huán)狀結構,可以結合到從RNA聚合酶中RNA通道釋放出的RNA單鏈區(qū)段;Rho蛋白同時具有ATPase活性,一旦與轉錄物結合后可以利用水解ATP的能量把RNA從模板鏈與聚合酶中釋放出來.通常Rho蛋白可以結合到RNA中rut位點(Rhoutilizationsite),rut位點長度一般為40nt,富含C,且不形成二級結構;另外,Rho蛋白不會結合已經結合了核糖體正在進行翻譯的RNA,而在細菌中,翻譯與轉錄是緊密偶聯的,因此,Rho一般只會結合終止已經超越基因末端的轉錄過程.

TheRhotranscriptionterminator第二節(jié)真核生物基因轉錄真核生物具有三種RNA聚合酶；與原核生物RNA聚合酶需要σ因子來啟動特定染色體區(qū)段轉錄不同，真核生物通常需要多種不同起始因子來協(xié)助RNA聚合酶在特定啟動子序列有效起始轉錄，這些起始因子統(tǒng)稱為普通轉錄因子（generaltranscri-ptionfactors，GTFs）.在體外條件下，GTFs與RNA聚合酶足以啟動特定DNA模板的轉錄；而在胞內條件下，還需要其它蛋白因子如mediator復合物，DNA結合調控蛋白及chromatin-modifyingenzymes來啟動促進轉錄。一、真核基因啟動子結構核心啟動子（corepromoter）是指體外條件下可以被RNA聚合酶Ⅱ精確識別結合,并起始轉錄所必需的一套最少序列元素。長度通常約為40bp,從轉錄起始位點向上游或下游延伸。在核心啟動子的上游通常還存在其它一些調控序列，如近啟動子元素（promoterproximalele-ments），上游激活序列(upstreamactivatorsequences)，增強子(enhancers)及抑制基因轉錄的沉默子(silencers)，邊界元素(boundaryelements)和絕緣子(insulators)等.所有這些調控元素都是通過與特定調控蛋白的結合來影響從核心啟動子的轉錄。PolⅡcorepromoter前起始復合物的形成位點是核心啟動子的TATA元素。GTFs中的TFⅡD首先通過TBP亞基結合到TATA序列上而形成一個其它GTFs與RNA聚合酶Ⅱ對啟動子結合的平臺。體外實驗結果顯示，其它GTFs與RNA聚合酶Ⅱ按照一定的順序在啟動子上完成組裝。前起始復合物形成后在特定條件下，在TFⅡH解旋酶活性的催化下引起啟動子區(qū)域解鏈，并同時對RNA聚合酶Ⅱ大亞基羧基端(C-terminaldomain,CTD)七肽重復序列中（Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser）的Ser進行磷酸化修飾，使RNA聚合酶Ⅱ起始轉錄并脫離其它GTFs。二、轉錄前復合物的形成普通轉錄因子可以協(xié)助RNA聚合酶Ⅱ結合到啟動子并協(xié)助實現從閉合復合物向開放復合物的轉化；同時還協(xié)助聚合酶脫離啟動子順利進入延伸階段。把結合在啟動子上準備起始轉錄的一整套GTFs及RNA聚合酶Ⅱ稱為前起始復合物（pre-initiationcomplex）.ThegeneraltranscriptionfactorsofRNApolymeraseIITBP1TFⅡA2TFⅡB1TFⅡE2TFⅡF3TFⅡH9TAFs11GTFsNumberofsubunitsTranscriptioninitiationbyRNApolymeraseⅡTBP-DNAcomplexTFIIB-TBP-promotercomplex由于真核生物染色體是以染色質結構存在，所以細胞內特定基因的轉錄還需要許多其它蛋白因子如轉錄調控蛋白,Mediatorcomplex,核小體修飾/重塑酶（nucleosome-modifyingenzymes）的協(xié)同作用等。結合在啟動子上游的轉錄調控蛋白通?？梢酝ㄟ^Mediatorcomplex的介導,協(xié)助并穩(wěn)定RNA聚合酶Ⅱ對啟動子的結合；Mediatorcomplex可以通過調節(jié)TFⅡH激酶活性而促進轉錄起始。酵母與人的Mediatorcomplex均含有>20亞基。Assemblyofthepre-initiationcomplexinpresenc