western-blot與蛋白質(zhì)雙向電泳的原理,方法及應(yīng)用

westernblot與蛋白質(zhì)雙向電泳的原理，方法及應(yīng)用演示人：胡祺祥，張鋒，余涵westernblot原理及方法1蛋白質(zhì)雙向電泳原理及方法2醫(yī)學(xué)應(yīng)用3Contents目錄第1章westernblot原理及方法一.基本原理通過(guò)PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體上，以固相載體上的這些蛋白質(zhì)或者多肽作為抗原與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)再與酶或者同位素標(biāo)記的第二抗體起作用，通過(guò)底物顯色或者放射自顯影來(lái)檢測(cè)特定基因表達(dá)的蛋白質(zhì)PAGE分離蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移底物顯色或者放射自顯影一抗，二抗雜交二.具體的方法和步驟I.蛋白質(zhì)樣品制備1.向細(xì)胞懸液中加入蛋白酶抑制劑2.細(xì)胞裂解液破碎細(xì)胞（原理是表面活性劑的兩親性）3.水溶液或者有機(jī)溶劑提取（后者適用于非極性側(cè)鏈多的蛋白）4.層析或者電洗脫制備目的蛋白II.SDS—PAGE電泳問(wèn)：什么決定了蛋白質(zhì)能走多遠(yuǎn)？首先明白：決定蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)快慢的是蛋白質(zhì)帶電量和蛋白質(zhì)的質(zhì)量那么：此處是什么起決定作用?SDS所帶電荷極多蛋白質(zhì)電荷相比之下可以忽略按體重分電荷III.轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜兩種方法1.半干法：2.濕法注意事項(xiàng)：IV.封閉封閉是什么?為什要要進(jìn)行封閉？V.雜交問(wèn)：什么是一抗，二抗？一抗是指對(duì)待測(cè)蛋白有免疫反應(yīng)的抗體二抗是指對(duì)一抗有免疫反應(yīng)的抗體（把一抗當(dāng)做抗原）問(wèn)：為什么要進(jìn)行兩次免疫反應(yīng)?1.信號(hào)放大，因?yàn)橐豢箍梢越Y(jié)合多個(gè)二抗2.價(jià)格便宜，一種二抗可以對(duì)多種一抗起作用，只需要找到可以使用的二抗即可3.可以有較多的選擇，而且，帶標(biāo)記的二抗可以直接購(gòu)買缺點(diǎn)：二次免疫導(dǎo)致的非特異性條帶可能影響結(jié)果VI.顯色

第2章蛋白質(zhì)雙向電泳實(shí)驗(yàn)原理第一向：等點(diǎn)聚焦電泳（IEF，isoelectricfocusing）第二向：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）等電聚焦電泳在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步增加的pH梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)放進(jìn)此體系時(shí)，不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)到或聚焦于與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳在聚丙烯凝膠中加入陰離子去污劑SDS，SDS將蛋白質(zhì)的二硫鍵、氫鍵及疏水鍵打開使蛋白質(zhì)變性，且包裹在變性蛋白表面。SDS帶有大量負(fù)電荷，使蛋白質(zhì)本身帶有的電荷可忽略。不同蛋白質(zhì)分子的遷移率主要決定于其帶有的SDS量，即蛋白質(zhì)分子的大小。電泳中，不同的蛋白質(zhì)根據(jù)其分子大小移動(dòng)到不同位置，小分子較大分子移動(dòng)快。PAAG是丙烯酰胺單體和甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)劑按一定比例混合，在催化劑（如過(guò)硫酸銨）作用下聚合而成的交叉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，使其產(chǎn)生分子篩效應(yīng)。以此凝膠為支持物的電泳為PAGE實(shí)驗(yàn)方法與步驟樣品制備IPG膠條上樣第一向等電聚焦IPG膠條平衡第二向SDS凝膠的染色圖像處理分析樣品制備雙向電泳的最關(guān)鍵步驟之一原則：盡可能多地提取總蛋白質(zhì)，盡可能簡(jiǎn)單的操作步驟，防止樣品提取過(guò)程中的化學(xué)修飾，去除樣品中核酸、鹽離子等干擾物質(zhì)增加樣品溶解性的方法：①變性劑，使蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)暴露，降低接近疏水殘基的能量域。如尿素、硫脲等②表面活性劑，可溶解疏水基團(tuán)，如離子去污劑SDS，非離子去污劑NP-40及兩性離子去污劑CHAPS，其中CHAPS最好③還原劑，可使蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底預(yù)處理細(xì)胞（清洗等）除雜質(zhì)溶解破碎細(xì)胞沉淀蛋白質(zhì)IPG膠條上樣與第一向等點(diǎn)聚焦將樣品與水化上樣緩沖液混合，體積比約為1:4混合物加入膠條槽除去保護(hù)膜，將膠條酸性端（尖端）朝膠條槽陽(yáng)極方向放入，慢慢下壓，最后放入堿性端（平端），使溶液浸濕膠條，避免生成氣泡在膠條上覆蓋適量礦物油，蓋上蓋將膠條槽平放在電泳儀上，對(duì)好正負(fù)極，設(shè)定等電聚焦程序IPG膠條平衡聚焦結(jié)束的膠條應(yīng)立即進(jìn)行平衡將膠條放入平衡緩沖液Ⅰ中，振蕩15分鐘將膠條放入平衡緩沖液Ⅱ中，振蕩15分鐘用去離子水潤(rùn)洗膠條1秒，用濾紙?jiān)谀z條邊緣吸去多余水分平衡緩沖液Ⅰ：--含DTT（二硫蘇糖醇）--使變性的非烷基化蛋白質(zhì)處于還原狀態(tài)平衡緩沖液Ⅱ：--含碘乙酰胺--使蛋白質(zhì)巰烷基化，防止其在電泳過(guò)程中重新氧化第二向SDS膠條染色硝酸銀染色優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高缺點(diǎn)：重復(fù)性低，質(zhì)譜兼容性低考馬斯亮蘭染色優(yōu)點(diǎn)：重復(fù)性高，質(zhì)譜兼容性高缺點(diǎn)：靈敏度低熒光染色優(yōu)點(diǎn)：重復(fù)性高，質(zhì)譜兼容性高，靈敏度高缺點(diǎn)：價(jià)格貴硝酸銀染色考馬斯亮蘭染色熒光染色圖像處理分析流程凝膠圖像掃描圖像加工斑點(diǎn)檢查與定量凝膠配比數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)呈遞和解釋2-DE數(shù)據(jù)庫(kù)的建立第3章醫(yī)學(xué)應(yīng)用01過(guò)敏原檢測(cè)及方法建立02診斷寄生蟲病03檢測(cè)基因產(chǎn)物表達(dá)及水平04檢測(cè)病毒感染westernblot的臨床應(yīng)用由于許多過(guò)敏原是來(lái)著生物體的機(jī)體，尤其表現(xiàn)在蛋白質(zhì)上。例如魚類。魚類是最常見的易引起過(guò)敏反應(yīng)的食物，而小清蛋白是最常見的過(guò)敏原。在建立魚小清蛋白檢測(cè)及方法建立過(guò)程中利用westernblot法完成免疫鑒定，為低免疫產(chǎn)品研制生產(chǎn)提供理論依據(jù)。過(guò)敏原檢測(cè)及方法建立利用westernblot法進(jìn)行寄生蟲病檢測(cè)一般從寄生蟲特異抗原入手，檢測(cè)人體液內(nèi)相關(guān)蛋白的含量，以確定是否感染寄生蟲病。優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，始于用于疑似病人的診斷，但是由于費(fèi)用高昂，費(fèi)時(shí)且技術(shù)要求高所以建議做推廣但不建議普及。一般檢測(cè)常用ELISA檢測(cè)。應(yīng)用病例：診斷囊蟲病：運(yùn)用DNA重組技術(shù),構(gòu)建來(lái)源于豬囊尾蚴的cDNA表達(dá)文庫(kù),以囊蟲病患者血清及病豬血清為抗體,從中篩選出4個(gè)特異性抗原（cC1、cC2、cP1、cH1）,這些抗原克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo),形成β-半乳糖苷酶-豬囊尾蚴特異性抗原的融合蛋白(fusionprotein,