生物化學(xué)教學(xué)課件：SBTI抑制常數(shù)ki的測定

SBTI抑制常數(shù)ki的測定定義：有些物質(zhì)能與酶分子上某些必須基團(tuán)結(jié)合（作用),使酶的活性中心的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，導(dǎo)致酶活力下降或喪失，這種現(xiàn)象稱為酶的抑制作用。能夠引起酶的抑制作用的化合物則稱為抑制劑（inhibitor)。抑制作用的類型：(1)不可逆抑制作用：抑制劑與酶反應(yīng)中心的活性基團(tuán)以共價形式結(jié)合，引起酶的永久性失活。(2)可逆抑制作用：抑制劑與酶蛋白以非共價方式結(jié)合，引起酶活性暫時性喪失。抑制劑可以通過透析等方法被除去，并且能部分或全部恢復(fù)酶的活性。根椐抑制劑與酶結(jié)合的情況，又可以分為三類：競爭性抑制：某些抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與底物相似，因而能與底物竟?fàn)幣c酶活性中心結(jié)合。當(dāng)抑制劑與活性中心結(jié)合后，底物被排斥在反應(yīng)中心之外，其結(jié)果是酶促反應(yīng)被抑制了。竟?fàn)幮砸种仆ǔ？梢酝ㄟ^增大底物濃度，即提高底物的競爭能力來消除。競爭性抑制可用下式表示：有競爭性抑制劑存在時，Km值增大(1+[I]/Ki)倍，且Km值隨[I]的增高而增大；在[E]固定時，當(dāng)[S]﹥﹥Km(1+[I]/Ki),Km(1+[I]/Ki)項(xiàng)可忽略不計(jì)，則v=Vmax，即最大反應(yīng)速度不變。競爭性抑制作用的速度方程：競爭性抑制作用的Lineweaver–Burk圖：非競爭性抑制：酶可同時與底物及抑制劑結(jié)合，引起酶分子構(gòu)象變化，并導(dǎo)至酶活性下降。由于這類物質(zhì)并不是與底物競爭與活性中心的結(jié)合，所以稱為非競爭性抑制劑。如某些金屬離子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能與酶分子的調(diào)控部位中的-SH基團(tuán)作用，改變酶的空間構(gòu)象，引起非競爭性抑制。非竟?fàn)幮砸种撇荒芡ㄟ^增大底物濃度的方法來消除。非競爭性抑制可用下式表示：有非競爭性抑制劑存在時，V值減小(1+[I]/Ki)倍，且V值隨[I]的增高而降低；Km值不變。非競爭性抑制作用的速度方程：非競爭性抑制作用的Lineweaver–Burk圖：有反競爭性抑制劑存在時，Km和V值均減小(1+[I]/Ki)倍，且都隨[I]的增高而降低。反競爭性抑制：酶只有在與底物結(jié)合后，才能與抑制劑結(jié)合，引起酶活性下降。反競爭性抑制可用下式表示：反競爭性抑制作用的速度方程：反競爭性抑制作用的Lineweaver–Burk圖：競爭性抑制作用Ki的求解方法1.從雙倒數(shù)圖計(jì)算出表觀米氏常數(shù)Kmapp，然后代入Kmapp=Km(1+[I]/Ki)可計(jì)算出Ki。Linerweaver-Burkplotofcompetitiveinhibition2.雙倒數(shù)回歸確定Ki值：使用dixon作圖（1/v對[I]）得到ki常數(shù)。實(shí)驗(yàn)試劑

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（1）30mmol/LBAPNA（苯甲酰-L-精氨酸-對硝基苯胺（臨用現(xiàn)配）：稱取1.305gBAPNA溶于1mLDMSO,以Tris-CaCl2緩沖液定容至100mL。（2）3mmol/LBAPNA（臨用現(xiàn)配）。（3）0.05mol/L、pH8.2Tris-HCl緩沖液,含0.2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）CaCl2。

（4）0.2mol/L鹽酸溶液

（5）trpsin蛋白酶抑制劑(SBTI):3X10-5M.

（6）胰蛋白酶液：以0.001mol/LHCl（pH=3.0）配制成2mg/mL，每次取100uL,終濃度為2.86uM測定方法1.BAPNA（苯甲酰-L-精氨酸-對硝基苯胺）酶活測定法：

同Km的測定。2.Ki的測定：測定體系在不同濃度的底物（0.5mM,0.75mM,1.0mM,2.5mM,5.0mM,10mM）,抑制劑濃度（0，