征求意見稿-腹瀉糞便標(biāo)本中溶藻弧菌檢驗

1T/BPMAXXXX—2023腹瀉糞便標(biāo)本中溶藻弧菌檢驗本文件給出了人體腹瀉糞便標(biāo)本中溶藻弧菌的檢驗方法。本文件適用人體腹瀉糞便標(biāo)本中溶藻弧菌的檢驗。2規(guī)范性引用文件GB19489實驗室生物安全通用要求。3術(shù)語和定義本文件未給出術(shù)語和定義。4主要設(shè)備4.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃,42℃±1℃。4.2恒溫水浴箱：56℃±1℃。4.3全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。4.4實時熒光PCR儀。4.5MALDI-TOFMS微生物質(zhì)譜分析系統(tǒng)。5主要培養(yǎng)基和試劑5.13%氯化鈉堿性蛋白胨水：見附錄A.1。5.2硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂：見附錄A.2。5.3弧菌顯色培養(yǎng)基。5.43%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂：見附錄A.3。5.53%氯化鈉三糖鐵瓊脂：見附錄A.4。5.6生化鑒定試劑盒。6檢驗程序溶藻弧菌的檢驗程序見圖1。2T/BPMAXXXX—2023圖1溶藻弧菌檢驗程序7操作步驟7.1樣本的收集盡量在患者使用抗生素前無菌采集新鮮糞便標(biāo)本3g～5g(或者黃豆至蠶豆大小)，2h內(nèi)運送到檢測實驗室，若運送時間超過2h者，標(biāo)本應(yīng)放入Cary-Blair運送培養(yǎng)基中；便拭子或者肛拭子，可放入Cary-Blair運送培養(yǎng)基中室溫條件下當(dāng)天運送至實驗室。7.2分離培養(yǎng)7.2.1直接分離培養(yǎng)糞便標(biāo)本直接劃線接種于TCBS和弧菌顯色培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。7.2.2增菌分離培養(yǎng)7.2.2.1增菌從便盒中挑取黃豆粒大小糞便標(biāo)本(水樣便300uL～500uL),加入到10mL的3%氯化鈉堿性蛋白胨水中，充分混勻后進(jìn)行增菌培養(yǎng)；將便拭子或者肛拭子直接放入10mL的3%氯化鈉堿性蛋白胨水中，充分?jǐn)D壓混勻，取出棉簽后進(jìn)行增菌培養(yǎng)，36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。3T/BPMAXXXX—20237.2.2.2實時熒光PCR方法快速篩查（選做）7.2.2.2.1DNA提取直接取7.2.2.1獲得的增菌液1mL加到無菌離心管中,8000r/min離心2min,吸棄上清，加入500uL無菌超純水，充分混勻后制成肉眼可見的混濁菌懸液,煮沸10min,12000r/min離心5min,取上清液用于PCR檢測。若不能及時檢測則于-20℃保存?zhèn)溆?。也可利用?xì)菌基因組提取試劑盒提取DNA,操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。7.2.2.2.2PCR檢測實時熒光PCR反應(yīng)體系體積為20uL：2×通用PCR反應(yīng)混合物(PremixExTaqTM)10uL、上下游引物(10umol/L)各0.4uL、探針(10umol/L)0.4uL、模板DNA2uL,水補足至20uL。引物和探針序列見表1。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火延伸20s,循環(huán)40次，在退火階段檢測熒光。表1溶藻弧菌實時熒光PCR引物和探針的序列及產(chǎn)物長度核苷酸序列(5'～3')產(chǎn)物長度COLFGTGGCTTACACGTTGGAATGATCCOLRTTTGGCAAGGTCTGTTTGGTTACCOLPHEX－CACAAATTGCTCGTTCCACTGCCCACC－BHQ17.2.2.2.3結(jié)果判定Ct值≥40.0,判定樣品檢測結(jié)果為陰性，報告未檢出溶藻弧菌；Ct值≤35.0,可判定該樣品檢測結(jié)果為溶藻弧菌核酸陽性；Ct值在35.0與40.0之間,需重新檢測，如重測Ct值仍在此區(qū)間且曲線呈標(biāo)準(zhǔn)的S型且有明顯的指數(shù)增長期，則判斷為陽性，否則判斷為陰性。判定溶藻弧菌核酸陽性者，需進(jìn)行分離培養(yǎng)及后續(xù)的鑒定試驗。7.2.2.3分離取增菌液劃線接種于TCBS平板和弧菌顯色培養(yǎng)基平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。典型的溶藻弧菌菌落在TCBS上呈圓形、表面光滑、大而扁平的黃色菌落，直徑2mm～3mm。在弧菌顯色培養(yǎng)基上的菌落特征參照產(chǎn)品說明書進(jìn)行判定。7.3純培養(yǎng)在TCBS平板和弧菌顯色培養(yǎng)基平板上各挑取5個可疑菌落，劃線接種3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。7.4鑒定溶藻弧菌的鑒定可采用生化鑒定或MALDI-TOFMS鑒定或?qū)崟r熒光PCR方法鑒定。7.4.1生化鑒定7.4.1.1挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落，接種3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，36℃±1℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。溶藻弧菌在3%氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為底層變黃不變黑，無氣泡，斜面顏色變黃，有動力。7.4.1.2嗜鹽性試驗：挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落，分別接種0%、6%、8%和10%不同氯化鈉濃度的胰胨水，36℃±1℃培養(yǎng)24h，觀察液體混濁情況。溶藻弧菌在無氯化鈉的胰胨水中不生長，在3%氯化鈉、6%氯化鈉、8%氯化鈉和10%氯化鈉的胰胨水中生長旺盛。4T/BPMAXXXX—20237.4.1.3取純培養(yǎng)物分別接種含3%氯化鈉的甘露醇試驗培養(yǎng)基、賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基、MR-VP培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h后觀察結(jié)果；3%氯化鈉三糖鐵瓊脂隔夜培養(yǎng)物進(jìn)行ONPG試驗。可選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。溶藻弧菌的生化反應(yīng)及與其它弧菌鑒別見表2。表2溶藻弧菌生化反應(yīng)及與其它弧菌的鑒別名稱氧化酶賴氨酸精氨酸鳥氨酸明膠脲酶V︱P42℃生長蔗糖D︱纖維二糖乳糖阿拉伯糖D︱甘露糖D︱甘露醇ONPG嗜鹽性試驗氯化鈉含量%0368溶藻弧菌V.alginolyticus++-++-+++---++--++++副溶血性弧菌V.parahaemolyticus++-++V-+-V-+++--+++-創(chuàng)傷弧菌V.vulnificus++-++--+-++-+V+-++--霍亂弧菌V.cholerae++-++-V++---+++++---擬態(tài)弧菌V.mimicus++-++--+----+++++---河弧菌V.fluvialis+-+-+--V++-++++-++V-弗氏弧菌V.furnissii+-+-+---+--++++-+++-梅氏弧菌V.metschnikovii-++-+-+V+---+++-++V-霍利斯弧菌V.hollisae+------nd---++---++--注：＋表示陽性；－表示陰性；nd表示未試驗；V表示可變。7.4.2MALDI-TOFMS檢測7.4.2.1檢測步驟MALDI-TOFMS檢測步驟如下：a)在1.5mL離心管中加入300μL去離子水。b)挑取1個～2個單菌落于離心管中，充分振蕩混勻。5T/BPMAXXXX—2023c)加入900μL無水乙醇，充分混勻。d)室溫離心2min～4min，轉(zhuǎn)速8000r/min～14800r/min，傾去上清，再次離心，使用移液槍完全除去上清，操作過程中不應(yīng)接觸沉淀。e)37℃~40℃干燥沉淀2min～5min，至沉淀表面無明顯水跡。f)加入裂解液1（10μL），振蕩混勻。g)加入裂解液2（10μL），充分混勻。h)室溫離心2min～4min，轉(zhuǎn)速8000r/min～14800r/min。i)吸取1μL上清液，滴加到樣品靶上，并在室溫下晾干。j)晾干后取1μL基質(zhì)溶液覆蓋在上述樣品點上，并在室溫下晾干。k)將樣品靶放入質(zhì)譜儀進(jìn)行測定。7.4.2.2儀器參數(shù)設(shè)置選擇線性操作模式，正離子模式，檢測范圍：2000Da-20000Da；激光點擊數(shù)：每圖譜40次(6次激光累積)；激光頻率：60.0Hz；離子源加速電壓：20kV。對可疑菌落進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集并保存，通過autofms操作軟件進(jìn)行分析鑒定。7.4.2.3結(jié)果判讀MALDI-TOFMS鑒定結(jié)果給出數(shù)據(jù)庫中與鑒定菌種最為匹配的10個菌株種屬，并給出相對應(yīng)的匹配分值，分值6分以下不可信，6-9分需要查看十個明細(xì)，9分以上種水平可信。7.4.2.4MALDI-TOFMS結(jié)果判定及報告可疑菌落經(jīng)MALDL-TOFMS鑒定為溶藻弧菌，且匹配分值大于等于9分，判定檢測結(jié)果為陽性。（此處為AutofMS1000MALDI-TOFMS質(zhì)譜儀操作方法及技術(shù)參數(shù)，其它品牌和型號請參見儀器說7.4.3熒光PCR鑒定7.4.3.1將TCBS或弧菌顯色培養(yǎng)基上的溶藻弧菌可疑菌落純培養(yǎng)物轉(zhuǎn)至500uL無菌超純水中，充分混勻后制成肉眼可見的混濁菌懸液,煮沸10min,12000r/min離心5min,取上清液用于PCR檢測。若不能及時檢測則于-20℃保存?zhèn)溆?。也可用商業(yè)化的DNA提取試劑盒，按其說明提取制備DNA模板。7.4.3.2PCR檢測和結(jié)果判定同7.2.2.27.5結(jié)果與報告根據(jù)可疑菌落系統(tǒng)生化和（或）MALDI-TOFMS鑒定結(jié)果和（或）實時熒光PCR結(jié)果，報告標(biāo)本中檢出或未檢出溶藻弧菌。7.6生物安全樣本檢測和廢棄物處理按照GB19489規(guī)定執(zhí)行。6T/BPMAXXXX—2023（規(guī)范性）培養(yǎng)基與試劑A.13%氯化鈉堿性蛋白胨水A.1.1成分蛋白胨10.0g氯化鈉30.0g蒸餾水1000.0mLA.1.2制法校正pH至8.5±0.2，121℃高壓滅菌10min。A.2硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂A.2.1成分蛋白胨10.0g酵母浸膏5.0g檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O10.0g硫代硫酸鈉（Na2S2O3）10.0g氯化鈉10.0g牛膽汁粉5.0g檸檬酸鐵1.0g膽酸鈉3.0g蔗糖20.0g溴麝香草酚藍(lán)0.04g麝香草酚藍(lán)0.04g瓊脂15.0g蒸餾水1000.0mLA.2.2制法將各成分溶于蒸餾水中，校正pH至8.6±0.2，加熱煮沸至完全溶解。冷至50℃左右傾注平板備用。A.33%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂A.3.1成分7T/BPMAXXXX—2023A.3.2胰蛋白胨大豆蛋白胨氯化鈉瓊脂蒸餾水制法5.0g30.0g將A.3.1中成分溶于蒸餾水中，校正pH至7.3±0.2，121℃高壓滅菌15min。A.43%氯化鈉三糖鐵瓊脂A4.1成分蛋白胨?蛋白胨牛肉膏酵母浸膏氯化鈉乳糖蔗糖葡萄糖硫酸亞鐵（FeSO4）苯酚紅硫代硫酸鈉（Na2S2