dpp-4抑制劑aloglipin對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型的治療機(jī)制

dpp-4抑制劑aloglipin對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型的治療機(jī)制

炎癥包括潰瘍性胃炎（iu）和克羅恩?。╟d）。mc以大便粘膜炎癥為特征，克羅恩病以斑狀板和透壁炎癥為特征，可影響消化系統(tǒng)的任何部位。炎癥性腸病在發(fā)病機(jī)制上屬自身免疫疾病,臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥性腸道疾病。近年來有研究發(fā)現(xiàn),胰高血糖素樣肽-2(glucagon-likepeptide-2,GLP-2)具有促進(jìn)腸黏膜增長(zhǎng),抑制炎性介質(zhì)表達(dá)的作用,二肽基肽酶-4(dipeptidylpeptidase-4,DPP-4)抑制劑能夠通過抑制DPP-4酶而達(dá)到降低GLP-2降解失活的作用,這為炎癥性腸病的治療開辟新的途徑。Alogliptin為日本武田公司開發(fā)的一種用于治療2型糖尿病的DPP-4高選擇性抑制劑,而對(duì)于其治療炎癥性腸病的作用還少見報(bào)道。本研究通過TNBS灌腸誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生潰瘍性結(jié)腸炎模型,觀察Alogliptin對(duì)模型小鼠MPO值,血清IL-8、TNF-α和GLP-2的影響,探討其治療炎癥性腸病的治療機(jī)制。1材料和方法1.1羧甲基纖維素鈉混懸液的配制Alogliptin由重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院提供,通過成分鑒定和含量分析,臨用時(shí)以0.5%羧甲基纖維素鈉配成相應(yīng)質(zhì)量濃度的混懸液備用。柳氮磺吡啶(SASP,250mg/片,上海三維制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào):200903C18)用刀片刮去包衣,呈現(xiàn)黃褐色,研碎后加0.5%CMC-Na配成26g/L的混懸液備用。1.2試劑盒和試劑成年雄性清潔級(jí)BALB/c小鼠48只,體質(zhì)量(25±3)g,由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;50g/L2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-TNBS)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品,IL-8檢測(cè)試劑盒胰高血糖素肽酶2檢測(cè)試劑盒(glucagon-likepeptide2,GLP-2)購(gòu)于重慶升博試劑公司,腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒購(gòu)于上海億欣生物試劑公司,低溫冷凍離心機(jī)購(gòu)于Thermo公司,酶標(biāo)儀購(gòu)于PerkinElmer公司。1.3模型分組與飼養(yǎng)將BALB/c小鼠分成A、B、C、D、E、F組,每組8只,A、B、C組分別為Alogliptin1、0.3、0.1mg/kg劑量組,D組為SASP治療陽性對(duì)照組(SASP520mg/kg),E組為模型對(duì)照組,F組為空白組。將BALB/c小鼠禁食不禁水16h后,用乙醚輕度麻醉,用直徑約為2mm的導(dǎo)管經(jīng)肛門插入結(jié)腸約4cm,A、B、C、D、E組每只小鼠注入70mg/kg的TNBS,F組每只小鼠注入等體積的生理鹽水,將小鼠肛門捏住倒提5min,待藥物完全吸收后放入籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。灌腸結(jié)束后6h,分別灌胃給予Aloglitpin、柳氮磺吡啶,連續(xù)治療7d后眼球取血測(cè)定血清IL-8、TNF-α和GLP-2值,處死小鼠,取結(jié)腸組織測(cè)定MPO值。1.4形態(tài)變異檢測(cè)每日觀察和記錄小鼠的體質(zhì)量和大便情況,疾病活動(dòng)度指數(shù)(DAI)=(體質(zhì)量減輕率分?jǐn)?shù)+糞便性狀分?jǐn)?shù)+隱血程度分?jǐn)?shù))/3,DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1;藥物治療7d后摘眼球取血,靜置30min后,4℃3000r/min離心20min。處死小鼠,取結(jié)腸組織分為2份,一份做HE染色,觀察結(jié)腸損傷狀況,另一份凍存于液氮中備用于MPO值檢測(cè)。大便隱血檢測(cè)采用聯(lián)苯胺法。1.5血清il-8、tnf-i和glp-2的血清含量結(jié)腸組織MPO值檢測(cè),血清IL-8、TNF-α、GLP-2檢測(cè)參照檢測(cè)試劑盒說明書。1.6統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以xˉ±s表示,組間比較采用方差分析和t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1小鼠稀便及采血指標(biāo)TNBS模型組小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、稀便、便血、懶動(dòng)、毛發(fā)散亂等,而Alogliptin治療組和SASP治療組小鼠稀便及便血情況明顯減輕,DAI評(píng)分較模型組有顯著降低(P<0.01),而Alogliptin高劑量治療組和柳氮磺吡啶治療組無顯著性差異(P>0.05)。見圖1。2.2小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)檢測(cè)正常組小鼠結(jié)腸黏膜上皮完整、連續(xù),細(xì)胞與腺體排列規(guī)則,黏膜、固有層內(nèi)血管和纖維間質(zhì)正常,肌層無異常;模型組小鼠結(jié)腸黏膜充血水腫,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),腸壁增厚,腺體中杯狀細(xì)胞明顯減少;Alogliptin高、中、低治療組和柳氮磺吡啶治療組與模型組比均有不同程度的減輕,特別是Alogliptin高劑量組和SASP治療組,除局部伴有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)外基本接近正常組織。見圖2。2.3高p>0.1與正常對(duì)照組比較,TNBS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型MPO值、IL-8、TNF-α的含量顯著增高(P<0.01)。與模型組比較,Alogliptin高、中劑量組和SASP治療組MPO值、IL-8、TNF-α含量明顯降低(P<0.05,P<0.01),對(duì)劑量有一定的依賴性;而Alogliptin高劑量治療組血清GLP-2的濃度明顯高于模型組小鼠(P<0.05)。見表2。3dpp-4在治療炎癥性腸病方面的應(yīng)用UC以腹痛、腹瀉、黏液血便、里急后重為主要臨床表現(xiàn),病變主要累及直腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸的黏膜層及黏膜下層,且病程遷延不愈。近年來對(duì)炎癥性腸病的研究很多,雖然炎癥性腸病的特異性致病因素至今尚不明確,但大量臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,在遺傳易感性的個(gè)體中,免疫系統(tǒng)異常是造成炎癥和組織損傷的內(nèi)在因素。而目前治療常用的3類藥物:水楊酸類、類固醇激素和免疫抑制劑,只能緩解癥狀,且存在停藥后易復(fù)發(fā)和長(zhǎng)期用藥不良反應(yīng)多等缺點(diǎn),因此開發(fā)治療炎癥性腸病的新藥具有重要的意義。2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)是一種半抗原物質(zhì),當(dāng)乙醇灼傷結(jié)腸黏膜后與組織蛋白的賴氨酸ε-氨基團(tuán)結(jié)合,成為抗原,使T淋巴細(xì)胞致敏,使與半抗原結(jié)合的動(dòng)物自身細(xì)胞遭到破壞,從而導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生。TNBS代謝產(chǎn)生的O-2、H2O-2等活性氧及過氧化物的毒性物質(zhì)損傷腸壁組織和上皮細(xì)胞,其病理表現(xiàn)為結(jié)腸水腫、充血,腸壁增厚,黏膜糜爛,潰瘍形成。該模型動(dòng)物存活率高,制作簡(jiǎn)單,是現(xiàn)在常用的UC動(dòng)物模型之一。Alogliptin為日本武田公司近年來研發(fā)的一種用于治療糖尿病的DPP-4高選擇性抑制劑,其主要作用機(jī)制是抑制體內(nèi)GLP-1的濃度,從而提高胰島β細(xì)胞功能達(dá)到控制血糖的目的,具有良好的口服生物利用度,并且劑量安全范圍很大,在臨床的應(yīng)用中幾乎沒有嚴(yán)重的不良反應(yīng)。但對(duì)于Alogliptin在治療炎癥性腸病方面的研究卻很少,而且作用機(jī)制也尚不明確。Bank等的研究發(fā)現(xiàn),DPP-4抑制劑能夠治療DSS誘導(dǎo)的BALB/c小鼠腸炎。有研究發(fā)現(xiàn),DPP-4抑制劑能夠治療DSS誘導(dǎo)的小鼠腸炎,且小鼠體內(nèi)GLP-2的濃度也顯著升高,而在DPP-4基因敲除小鼠體內(nèi),GLP-2的濃度較普通小鼠高,此外,在經(jīng)DPP-4抑制劑治療后,GLP-2的活性增加,處在恢復(fù)階段的小鼠隱窩細(xì)胞增殖明顯。本實(shí)驗(yàn)研究表明,Alogliptin作為一種DPP-4高選擇性抑制劑,能夠顯著升高腸炎小鼠體內(nèi)GLP-2的水平(P<0.05),對(duì)TNBS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型具有良好的治療作用,其治療機(jī)制可能是通過抑制DPP-4酶而達(dá)到降低GLP-2降解失活,而GLP-2與大腸和小腸細(xì)胞的生長(zhǎng)密切相關(guān),一方面GLP-2可直接促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖,另一方面作用腸內(nèi)神經(jīng)元,腸內(nèi)分泌細(xì)胞的GLP-2R,使二者產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)和激素(一氧化氮、血管活性肽、5-羥色胺等)而促進(jìn)腸隱窩細(xì)胞增殖;GLP-2還作用腸黏膜下的肌纖維母細(xì)胞GLP-2R,促進(jìn)其生長(zhǎng)因子IGF-1、IGF-2和KGF等的產(chǎn)生,改善腸上皮增殖和功能,從而減輕炎性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),Alogliptin治療組和模型組小鼠血清GLP-2的含量較正常對(duì)照組有顯著升高(P<0.05),而且呈劑量依賴性,而SASP治療組與正常對(duì)照組無明顯差異。該研究結(jié)果提示,Alogliptin對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用,可能是通過降低腸道內(nèi)GLP-2的降解,相對(duì)增加體內(nèi)GLP-2的濃度,而發(fā)揮的治療作用,而模型組小鼠GLP-2的比例升高可能是由于其在腸道損傷后,通過某些反應(yīng)來維持GLP-2的水平,以盡可能的修復(fù)腸道上皮。MPO是評(píng)價(jià)炎癥程度的指標(biāo),其活性反映了中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)目和活性。IL-8是一種促炎細(xì)胞因子,主要由單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞以及T淋巴細(xì)胞在IL-1、TNF-α和外源性因子脂多糖的刺激下產(chǎn)生,許多研究發(fā)現(xiàn)IL-8在IBD的發(fā)病及治療中起著十分重要的作用。TNF-α可誘導(dǎo)主要組織相容性復(fù)合抗原Ⅱ在結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞表面表達(dá),增強(qiáng)基質(zhì)主要金屬蛋白酶活性,促進(jìn)胃腸細(xì)胞組織損傷,改變腸上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和屏障特性,刺激或抑制腸上皮細(xì)胞的增殖,上調(diào)T細(xì)胞、嗜酸性和嗜堿性細(xì)胞功能。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),Alogliptin能夠降低小鼠結(jié)腸MPO值、血清IL-8、TNF-α水平,使小鼠腸炎癥狀減輕,并能夠明顯降低小鼠的DAI評(píng)分,高劑量與陽性對(duì)照藥SASP的治療作用相似。SASP為磺胺類抗菌藥,是目前臨床上使用較為廣泛的治療潰瘍性結(jié)腸炎的藥物,其療效確切,然而在臨床使用過程中不良反應(yīng)較多,而且比較嚴(yán)重,作為DPP-4的高選擇性抑制劑,Alogliptin的不良反應(yīng)較柳氮磺吡啶少,在臨床觀察中,每日運(yùn)用12.5～25mg劑量時(shí),僅有10.8%～15.2%的患者發(fā)生皮膚干燥,皮疹等較輕微的不良反應(yīng),可能為治療潰瘍性結(jié)腸炎的治療提供新的治療途徑。在本實(shí)驗(yàn)中,測(cè)定腸炎小鼠結(jié)腸組織的MPO值,血清IL-8、TNF-α、GLP-2以及DAI評(píng)分,以了解TNB