曲克蘆丁在大鼠腸道中的代謝與轉(zhuǎn)化規(guī)律

曲克蘆丁在大鼠腸道中的代謝與轉(zhuǎn)化規(guī)律

特洛伊木馬是一種由羥乙基化合成的半合成黃酮類化合物，能抑制紅細(xì)胞血小板的聚集，防止血栓形成。同時，血氧飽和度增加，微循環(huán)改善，側(cè)支循環(huán)增加。臨床上常用于靜脈、慢性靜脈功能障礙、痔瘡、腦梗死、長距離飛行等微血管病的治療?？诜S酮苷類化合物的生物利用度低,血藥濃度低,其腸道的首過代謝作用不容忽視。大量的腸道微生物能產(chǎn)生豐富的酶類,使尚未吸收的黃酮苷類化合物發(fā)生糖苷鍵斷裂、去羥基化、甲基化等反應(yīng),甚至使黃酮類化合物的骨架C6-C3-C6斷裂為各種酚酸類代謝產(chǎn)物?，F(xiàn)采用培養(yǎng)離體大鼠腸道細(xì)菌的方法研究曲克蘆丁的體外代謝,用HPLC法測定曲克蘆丁的含量變化,考察細(xì)菌對曲克蘆丁的分解代謝作用,探討曲克蘆丁在消化道中生物轉(zhuǎn)化的一般規(guī)律。1實驗部分1.1藥品、試劑和儀器LC-20A高效液相色譜儀(日本島津)。曲克蘆丁原料藥(阿拉丁,純度97%);曲克蘆丁(批號100416-201004,純度95.2%)、蘆丁(批號:100080-200707,純度90.5%)對照品(中國食品藥品檢定研究院);L-半胱氨酸、L-抗壞血酸、牛肉膏、蛋白胨、營養(yǎng)瓊脂(杭州微生物試劑有限公司);甲醇為色譜純;水為純化水;其余試劑為分析純?！酳D大鼠(安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,合格證號:皖醫(yī)實動準(zhǔn)字第01號)10只,200±20g。1.2方法和結(jié)果1.2.1檢測條件a色譜柱為Shim-packODSC18柱(250mm×4mm,5μm),流動相為甲醇(A)-水(含1.7%冰乙酸,B),梯度洗脫(0~15min、41%A,15~30min、41%~65%A,30~40min、65%~41%A),流速為1.0mL·min-1,檢測波長為350nm,柱溫40℃,進(jìn)樣量20μL,以蘆丁為內(nèi)標(biāo)。1.2.2腸道菌液的制備取溶液A(0.78%K2HPO4)37.5mL、溶液B[0.47%KH2PO4+1.18%NaCl+1.2%(NH4)2SO4+0.12%CaCl2+0.25%MgSO4·H2O]37.5mL、溶液C(8%Na2CO3)50mL、25%L-抗壞血酸2mL、L-半胱氨酸0.5g、牛肉膏1g、蛋白胨1g、營養(yǎng)瓊脂1g,加蒸餾水至1L,用鹽酸調(diào)pH7.5~8.0,過濾后分裝,于121℃高壓滅菌15min,得厭氧培養(yǎng)液,于4℃保存。取大鼠新鮮糞便與生理鹽水,按1g∶4mL配制成腸道菌液。取1mL腸道菌液,加入9mL厭氧培養(yǎng)液,混勻,得10mL腸菌培養(yǎng)液。1.2.3貯備液的配制精密稱取曲克蘆丁和蘆丁對照品各10.0mg,分別置10mL量瓶中,加甲醇溶解并定容,制成1mg·mL-1的貯備液。曲克蘆丁貯備液用甲醇依次稀釋,制成1、5、10、50、100、200、400、800μg·mL-1工作液,于4℃保存。精密吸取腸菌培養(yǎng)液100μL,加入蘆丁溶液(20μg·mL-1)100μL和甲醇1mL,渦旋混勻1min后,于1×104r·min-1離心10min,取上清液于40℃吹干,殘渣用100μL流動相復(fù)溶,得供試品溶液。1.2.5試驗樣的制備取空白腸菌培養(yǎng)液,加入曲克蘆丁工作溶液,制成0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0μg·mL-1腸菌培養(yǎng)液樣品,按“1.2.3”項下方法處理后進(jìn)樣。以曲克蘆丁與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)、曲克蘆丁的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:Y=0.1213X-0.0239(r=0.9999),曲克蘆丁0.1~80μg·mL-1與峰面積比值的線性關(guān)系良好。1.2.6提取回收率試驗取空白腸菌培養(yǎng)液,加入適量曲克蘆丁對照品溶液,制成0.5、5.0、10.0μg·mL-1低、中、高濃度樣品,每個濃度平行制備5份,按“1.2.3”項下方法處理后進(jìn)樣,計算方法回收率;同時制備0.5、5.0、10.0μg·mL-1曲克蘆丁對照品溶液,直接進(jìn)樣;同等濃度腸菌培養(yǎng)液中曲克蘆丁峰面積與曲克蘆丁對照品峰面積的比值即為提取回收率(表1)。同法配制低、中、高濃度的腸菌培養(yǎng)液樣品,按“1.2.3”項下方法處理后進(jìn)樣,同日和連續(xù)5d各測定5份樣品。計算得日內(nèi)和日間精密度(表1)。1.2.7樣品處理和定量測定取“1.2.2”項下新鮮配制的腸菌培養(yǎng)液21份,分為7組。分別加入0.50mg曲克蘆丁,混勻,吹氮氣除空氣后,密封,造成腸道缺氧環(huán)境,置37℃分別培養(yǎng)0、1、2、4、6、12、24h后取出樣品。按“1.2.3”項下方法處理后進(jìn)樣測定。將各時間點曲克蘆丁的濃度對時間作圖。由圖2可知:曲克蘆丁在大鼠腸道細(xì)菌中的代謝速率較快,24h后即可代謝完全。1.2.8干浸膏的制備按“1.2.2”項下方法配制腸道菌群培養(yǎng)液2L,加入曲克蘆丁厭氧液培養(yǎng)24h,培養(yǎng)液用乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液,減壓濃縮,蒸干得干浸膏。采用硅膠柱層析(氯仿-甲醇梯度洗脫),氯仿-甲醇(10∶1)洗脫部分在薄層板上與曲克蘆丁苷元的斑點一致,合并洗脫液并回收溶劑,將氯仿重結(jié)晶,得到代謝產(chǎn)物。1.2.9曲克蘆丁苷元3a5e的代謝產(chǎn)物,即為3.代謝產(chǎn)物為黃色粉末,分子式為C12H22O10。1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ7.84(1H,m,2'-ArH),7.81(1H,s,6'-ArH),7.17(1H,d,J=8.5Hz,5'-ArH),6.79(1H,s,8-ArH),6.35(1H,d,J=1.9Hz,6-ArH),4.09(6H,m,J=11.6、5.3Hz,-OCH2-),3.78(6H,m,J=19.4、14.5Hz,-CH2OH)。13CNMR(75MHz,DMSO-d6):δ176.08(C=O),164.48(C-7),160.34(C-5),156.14(C-9),150.38(C-4'),147.97(C-2),146.52(C-3'),136.55(C-3),123.35(C-1'),121.87(C-6'),113.36(C-5'),113.18(C-2'),104.04(C-10),97.91(C-6),92.58(C-8),70.84(7-OCH2-),70.49(3'-OCH2-),70.36(4'-OCH2-),59.63(7-CH2OH),59.51(3'-CH2OH),59.32(4'-CH2OH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)的一致,故確定該代謝產(chǎn)物為曲克蘆丁脫去蕓香糖得到的曲克蘆丁苷元,即3',4',7-三(-O-羥乙基)槲皮素。2曲克蘆丁的檢測曲克蘆丁的最大吸收波長是254、350nm,且在254nm處的吸收比350nm略大,但254nm處的干擾峰太多,無法將曲克蘆丁與雜質(zhì)分開,所以,選擇350nm作為檢測波長。曾嘗試用乙腈、異丙醇、乙酸乙酯、甲醇、氯仿萃取處理腸道細(xì)菌培養(yǎng)液,結(jié)果顯示:乙腈和異丙醇萃取后的樣品仍含較多雜質(zhì),而氯仿和乙酸乙酯萃取后的樣品,雜質(zhì)雖然減少很多,但萃取率同時降低,最終選擇用甲醇萃取。取甲醇層吹干后,用流動相復(fù)溶測定,藥物能夠很好地分離出來,腸菌培養(yǎng)液中的少量雜質(zhì)不干擾曲克蘆丁的測定。文中結(jié)果表明:大鼠腸道細(xì)菌能快速地破壞曲克蘆丁的糖苷鍵,將其代謝為苷元。口服曲克蘆丁主要經(jīng)胃腸道吸收,這可能是造成口服曲克蘆丁后血藥濃度較低的原因之一。在大鼠尿液中未檢測到曲克蘆丁的苷元,因此,有必要通過研究口服曲克蘆丁的吸收機(jī)理及體內(nèi)轉(zhuǎn)化過程,來闡明曲克蘆丁在體內(nèi)發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。CLCnumber:R917Documentcode:AAr