辣根過氧化物酶標(biāo)記課件

實(shí)驗(yàn)原理（1）免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)是將一些既易測定又具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)記到特異性抗原或抗體分子上，通過這些標(biāo)記物的增強(qiáng)放大效應(yīng)來顯示反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。常用的標(biāo)記物包括熒光素、酶和放射性核素等，用這3種標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記的免疫檢測技術(shù)被稱為3大免疫標(biāo)記技術(shù)。目前，使用的免疫標(biāo)記物還有化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、鐵蛋白和膠體金等。1實(shí)驗(yàn)原理（1）免疫標(biāo)記技術(shù)1（2）辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體的原理a.辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP）

HRP廣泛分布于植物界，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多個同功酶組成，分子量為40,000,等電點(diǎn)為pH3～9，酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以O(shè)D403nm／OD275nm的比值RZ(德文ReinheitZahl)表示酶的純度。

HRP的催化反應(yīng)需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料，通過反應(yīng)可生成有色的氧化型染料(D)。

HRPDH2＋H2O2────→D＋2H2O（2）辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體的原理2b.辣根過氧化物酶標(biāo)記方法酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。辣根過氧化物酶的標(biāo)記常用過碘酸鹽氧化法，這種方法法只適用于含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基，醛基與抗體分子上的氨基形成Schiff堿而結(jié)合。后者可進(jìn)一步用NaBH４(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。3b.辣根過氧化物酶標(biāo)記方法3

在酶標(biāo)過程中一般都混有未結(jié)合的酶和抗體。游離酶理論上不影響最終的顯色。但游離的抗體則不同，它會與酶標(biāo)抗體競爭固相抗原，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量。因此需要對制備的酶結(jié)合物進(jìn)行純化，去除游離的酶和抗體。純化的方法很多，硫酸銨鹽析法最為簡便，但效果并不理想。用離子交換層析、分子篩法可得到最佳的分離效果，但費(fèi)用較貴。

4在酶標(biāo)過程中一般都混有未結(jié)合的酶和抗體。游離酶理

四操作步驟

（1）稱取5mgHRP溶解于0.5ml蒸餾水中。（2）向溶液中加入0.5ml新配的0.1MNaIO４溶液，混勻，4℃靜置30分鐘。（3）加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混勻，靜置30分鐘。（4）加入含5mg抗體的水溶液1ml，混勻裝入透析袋，pH9.5碳酸鹽緩沖液透析，4℃過夜。

5四操作步驟5（5）加0.2mL新配的5mg/mLNaBH４液，混勻，再置4℃,2h。（6）在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1h。（7）3000r/min離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/LpH7.4的PBS中。（8）將上述溶液裝入透析袋中，對0.15moL/LpH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000r/min離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。6（5）加0.2mL新配的5mg/mLNaBH４液，混酶制劑及其底物凡無毒性又能呈現(xiàn)有色化學(xué)反應(yīng)的酶，原則上均可作為標(biāo)記用。但作為標(biāo)記抗體用的酶應(yīng)滿足下列要求：(1)來源方便，易于純化；(2)比活性高，性質(zhì)穩(wěn)定；(3)酶活性和量能用簡單方法測定。目前在免疫酶技術(shù)中常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。7酶制劑及其底物凡無毒性又能呈現(xiàn)有色化學(xué)反應(yīng)的酶，原則上均可作由于辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多個同功酶組成，分子量為40,000,等電點(diǎn)為PH3～9,酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58％以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以O(shè)D403nm／OD275nm的比值RZ(德文ReinheitZahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右(最高可達(dá)3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，純度并不表示酶活性，如當(dāng)酶變性后，RZ值仍可不變。8由于辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidaHRP的催化反應(yīng)需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料，通過反應(yīng)可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應(yīng)的過程如下:

HRP

DH2＋H2O2────→D＋2H2O供氫體的種類很多，形成的產(chǎn)物特點(diǎn)不一。如DAB(3.3－二氨基聯(lián)苯胺)的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。5AS(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無色，現(xiàn)已很少應(yīng)用。OT(鄰聯(lián)甲苯胺)的特點(diǎn)是能產(chǎn)生鮮艷的藍(lán)綠色產(chǎn)物且靈敏度較高，但反應(yīng)中受溫度影響較大，而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，需要在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色，后者產(chǎn)物為藍(lán)綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定，空白可近于無色，靈敏度上據(jù)報(bào)道后者比前者可高4倍以上。9HRP的催化反應(yīng)需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2另外，還有一種供氫體稱ABTS[2,2'-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)綠色，且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑，因此酶促反應(yīng)中使用的H2O2不能過量。應(yīng)控制在經(jīng)較短時(shí)間反應(yīng)后呈色即達(dá)高峰（說明H２O２已消耗殆盡）。這樣即使再延長時(shí)間也不會增加反應(yīng)產(chǎn)物的顏色。10另外，還有一種供氫體稱ABTS[2,2'-邊氮基-雙(3-HRP標(biāo)記抗體的方法酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種,根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)不同可采用不同的方法。對于制備HRP結(jié)合物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。尤以簡易過碘酸鈉法更為常用。11HRP標(biāo)記抗體的方法酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種,根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)戊二醛二步法1.原理：戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jià)結(jié)合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。12戊二醛二步法1.原理：戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分2.標(biāo)記步驟：(1)稱取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。

(2)反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)SephadexG-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml／1分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。

(3)將待標(biāo)記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。

(4)用1MPH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3?小時(shí)。132.標(biāo)記步驟：(1)稱取HRP25mg溶于1.25％戊二(5)加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時(shí)。

(6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時(shí)。(7)

3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中。

(8)將上述溶液裝入透析袋中，對0.15MPH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。14(5)加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時(shí)。

3.結(jié)果判定：(1)定性及效價(jià)滴定：用特異性抗原(或抗體)同酶標(biāo)記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或免疫電泳試驗(yàn)。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里)對酶結(jié)合物進(jìn)行滴定(見本節(jié)(三)工作濃度的選擇)。153.結(jié)果判定：(1)定性及效價(jià)滴定：用特異性抗原(或抗

(2)定量和克分子比值測定：

(2)定量和克分子比值測定：可用分光光度計(jì)測定(光程1cm)。酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4

IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62酶量(mg／ml)

IgG量(mg／ml)酶量克分子比值＝────────÷───────＝───×4

40,000

160,000

IgG量16(2)定量和克分子比值測定：16注意事項(xiàng)（1）為提高標(biāo)記效率，應(yīng)嚴(yán)格掌握整個反應(yīng)體系中9的抗體含量。（2）碘酸鈉要新鮮配制。（3.）室溫?cái)嚢钑r(shí)須避光，室內(nèi)溫度一般在25℃為宜。標(biāo)記物每次透析前，須認(rèn)真檢查，防止漏液17注意事項(xiàng)（1）為提高標(biāo)記效率，應(yīng)嚴(yán)格掌握整個反應(yīng)體系中9的抗注意事項(xiàng)

（4）在具備高質(zhì)量HRP的條件下，所要標(biāo)記的抗體也要活性高,效價(jià)高(最低1∶16),純度高，親和力好，這是保證標(biāo)記物效價(jià)高，免疫活性好的首要條件。（5