基因表達(dá)分析技術(shù)

醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)第四章分子遺傳技術(shù)方法

基因表達(dá)分析技術(shù)METHODSFORANALYZINGGENEEXPRESSIONSpeaker：2023/10/21genemRNAProteinpolypeptidechainGeneExpression2023/10/22一、實(shí)時熒光定量PCR

（realtimequantitativePCR，RT-qPCR）2023/10/23實(shí)時熒光定量PCR

(realtimequantitativePCR，RT-qPCR)是熒光化學(xué)物質(zhì)與PCR產(chǎn)物相結(jié)合，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。熒光定量實(shí)時PCR與普通PCR的比較

在線實(shí)時監(jiān)控對樣品擴(kuò)增的整個過程進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控，能夠?qū)崟r地觀察到產(chǎn)物的增加，直觀地看到反應(yīng)的對數(shù)期

降低反應(yīng)的非特異性使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合，提高了PCR反應(yīng)的特異性

增加定量的精確性全程監(jiān)控，精確定量

結(jié)果分析更快捷方便，無需電泳

熒光染料

SYBRGreenI是一種結(jié)合于雙鏈DNA（double-strand,dsDNA）

小溝中的熒光染料，游離的熒光染料不發(fā)出信號，所以開始時檢測不到熒光信號，隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，染料不斷地與dsDNA結(jié)合而發(fā)出熒光，被熒光探測系統(tǒng)檢測到。2023/10/26非特異性熒光染料標(biāo)記：SYBRGreenI特異性熒光標(biāo)記：TaqMan優(yōu)點(diǎn)與特異性的熒光探針相比價格便宜

只需要設(shè)計PCR引物熒光信號強(qiáng)與其它探針相比設(shè)計簡單可用于多通道檢測可用于SNP的檢測缺點(diǎn)由于它和模板的結(jié)合是非特異性的，它可以和所有的雙鏈DNA包括引物和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，不能真實(shí)反映目的基因的擴(kuò)增情況比DNA結(jié)合染料價格高2023/10/27Ct（thresholdvalue）值是指熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，此時熒光信號明顯高于背景熒光信號。2023/10/28Ct值與模板起始濃度的關(guān)系

模板起始濃度越高，Ct值越小

Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系

如果模板濃度增加1倍，Ct值就提前1個循環(huán)到達(dá)如果模板濃度減少1倍，Ct值就滯后1個循環(huán)到達(dá)2023/10/29相對定量（Relativequantification）是計算要處理樣本相對于正常（內(nèi)參基因）樣本的基因表達(dá)量變化，屬于倍數(shù)關(guān)系式，擴(kuò)增效率達(dá)到100%時用2-??CT法來分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)過程中還要引入一個或多個內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化。內(nèi)參基因（Referencegene）是指在不同類型細(xì)胞、不同實(shí)驗(yàn)處理條件下恒定表達(dá)的一類管家基因，常用的內(nèi)參基因有b-actin、GAPDH、18sRNA、efla等。2023/10/210

相對定量分析方法12-ΔΔCt

前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100％且偏差在5％以內(nèi)。1．計算ΔCt：ΔCt=Ct靶基因－CtGAPDH，分別計算實(shí)驗(yàn)組和對照組的ΔCt。2．計算ΔΔCt：ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組－ΔCt對照組。3．計算相對表達(dá)量的差值。2－ΔΔCt靶基因AGAPDHΔCt對照組實(shí)驗(yàn)組

相對定量分析方法2：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

前提：目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率不同

待測樣品目的基因濃度

待測樣品內(nèi)參基因濃度

F=對照樣品目的基因濃度對照樣品內(nèi)參基因濃度二、基因表達(dá)分析的具體步驟1