survilinmrna及hpv1618與宮頸癌的相關(guān)性研究

survilinmrna及hpv1618與宮頸癌的相關(guān)性研究

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和惡化是一個多基因、多因素、多階段的過程。研究表明,宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染和細(xì)胞凋亡的調(diào)控有密切關(guān)系。Bcl-2基因是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制基因,是迄今研究最深入、最廣泛的凋亡調(diào)控基因之一;而Survivin是至今發(fā)現(xiàn)抗凋亡作用最強(qiáng)的基因。本研究采用原位雜交法在核酸水平檢測正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和宮頸癌中SurvivinmRNA及HPV16/18DNA的表達(dá),同時采用免疫組化法在蛋白水平檢測Bcl-2的表達(dá)。研究Survivin基因在宮頸癌中的表達(dá)及與Bcl-2、HPV16/18的相互關(guān)系,探討三者與宮頸癌的相關(guān)性。1數(shù)據(jù)和方法1.1病例對照分析收集2006年1月至2008年3月因CIN或?qū)m頸癌在我院就診患者的病理標(biāo)本155例,臨床資料均較完整。其中CIN組74例(CINⅠ級13例,CINⅡ級26例,CINⅢ級35例),宮頸癌組81例(70例鱗癌,11例腺癌);另取20例正常宮頸組織(包括宮頸良性病變)作對照組。根據(jù)2000年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行宮頸癌臨床分期:ⅠA期9例,ⅠB期17例,ⅡA期33例,ⅡB期12例,Ⅲ期10例。按組織病理學(xué)分級:高分化14例,中分化29例,低分化38例。按照腫瘤生長類型分為:外生型39例,內(nèi)生型15例,潰瘍型16例,頸管型11例。81例宮頸癌患者中54例行廣泛性子宮切除術(shù)加盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)(包括ⅠA期3例、ⅠB期17例、ⅡA期33例、ⅡB期1例),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者21例,無轉(zhuǎn)移者33例?；颊吣挲g19~78歲,平均40.06歲。取材前均未接受任何其他治療。1.2ccrtcacdacca基因回復(fù)性分析Survivin原位雜交檢測試劑盒(購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司),針對人Survivin靶基因的mRNA引物序列為:①5′-CCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACCACCGCA-3′;②5′-AAGCATTCGTCCGGTTGCGCTTTCCTTTCT-3′;③5′-AGAAAGTGCGCCGTGCCATCGAGCAGCTGG-3′。HPV16/18原位雜交試劑盒(購于福建泰普生物科學(xué)有限公司),鼠抗人Bcl-2多克隆抗體和免疫組化試劑盒(即用型二步法)(購自北京中杉生物技術(shù)公司)。1.3方法1.3.1樣品處理所有標(biāo)本及時以4%多聚甲醛(含有1/1000DEPC)固定,石蠟包埋,4μm連續(xù)切片。1.3.2msna核酸片段的制備切片脫蠟脫水,滴加新鮮配置的0.5%H2O2,室溫處理30分鐘;滴加3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶,37℃消化以暴露SurvivinmRNA核酸片段;滴加預(yù)雜交液,恒溫箱恒溫42℃4小時;滴加雜交液,恒溫箱42℃過夜;梯度SSC洗滌,依次滴加封閉液、生物素化鼠抗地高辛、SABC,DAB顯色、復(fù)染、透明,封片鏡檢。以不加Survivin探針只加預(yù)雜交液作為陰性對照。1.3.3免疫總免疫法檢測人單克隆抗體采用免疫組織化學(xué)染色(即用型二步法):石蠟包埋組織切片常規(guī)脫蠟脫水后,微波修復(fù)抗原,經(jīng)內(nèi)源性過氧化酶(3%H2O2)阻斷劑孵育10分鐘,PBS液沖洗。加Bcl-2鼠抗人單克隆抗體(稀釋度1∶50),4℃冰箱過夜。PBS沖洗后加入即用型二抗PV-6000,37℃孵育20分鐘,PBS沖洗,常規(guī)DAB顯色,蘇木素復(fù)染、透明,封片鏡檢。用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照,用已知陽性片作陽性對照。所有切片均在相同條件下進(jìn)行。1.3.4生物素化探針切片脫蠟水化,加蛋白酶K,37℃孵育18分鐘;梯度酒精脫水。每張切片加入10μl的生物素化探針,并蓋上蓋玻片。95℃變性10分鐘,37℃下濕盒中雜交10小時,去垢劑洗滌液浸片15分鐘去蓋玻片。加SPAP結(jié)合物,37℃孵育25分鐘,加酶底物BCIP/NBT室溫暗盒顯色15分鐘。核固紅復(fù)染,水性封片劑封片。1.3.5陽性細(xì)胞數(shù)法檢測所有切片采用雙盲法由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師閱片。參照Kawasaki等的半定量積分法判斷結(jié)果:光鏡下,Survivin和Bcl-2陽性表現(xiàn)為細(xì)胞漿中出現(xiàn)淡黃色至棕黃色顆粒。隨機(jī)觀察10個高倍鏡視野,按每高倍鏡視野陽性細(xì)胞數(shù)百分比記分:陽性細(xì)胞數(shù)小于5%為0分,5%~25%為1分,26%~50%為2分,51%~75%為3分,大于75%為4分。按著色強(qiáng)度記分:染色呈淡黃色者記為1分,染色呈黃色者記為2分,染色呈棕黃色者記為3分。兩種記分的乘積即為陽性強(qiáng)度:0分為陰性(-),1~4分為弱陽性(+),5~8分為中度陽性(++),9~12分為強(qiáng)陽性(+++)。HPV16/18DNA陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核中出現(xiàn)藍(lán)色或黑色顆粒。1.4博弈情境下fisher準(zhǔn)確性檢驗(yàn)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。率的比較采用χ2檢驗(yàn)(四格表或列聯(lián)表)或Fisher精確概率法,兩者相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析,設(shè)定P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2藥代動力學(xué)及組織學(xué)檢測2.1Bcl-2在3種組織中的表達(dá)Bcl-2陽性定位主要在細(xì)胞漿,呈淡黃色或棕黃色顆粒,見圖1(見插頁1-1)。由表1可見,Bcl-2在宮頸癌組和CIN組的陽性率明顯高于對照組(P=0.000),宮頸癌組又明顯高于CIN組。由表2可見,隨著宮頸癌臨床分期和組織分化程度的升高,Bcl-2陽性率逐漸上升,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而Bcl-2在有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及宮頸鱗癌、腺癌組織類型和腫塊類型方面比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.2HPV16/18在3種組織中的表達(dá)HPV16/18DNA陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核中出現(xiàn)藍(lán)色或黑色顆粒見圖2(見插頁1-1)。在對照組、CIN組和宮頸癌組中HPV16/18陽性率逐漸升高,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000),見表1。但HPV16/18的陽性率與CIN分級、組織類型、組織分化程度、臨床分期、腫塊類型及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P>0.05),見表2。2.3SurvivinmRNA在3種組織中的表達(dá)SurvivinmRNA在宮頸癌組織中以中度陽性(++)至強(qiáng)陽性(+++)多見,見圖3(見插頁1-1)。在宮頸癌組與CIN組的陽性率明顯高于對照組,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000),見表1。隨著宮頸癌組織分化程度和臨床分期的升高,SurvivinmRNA陽性率逐漸升高(P=0.004,P=0.042)。Survivin在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率高于無轉(zhuǎn)移組(P=0.006),但其在宮頸鱗癌與腺癌中的表達(dá)無差異,與腫塊類型亦無關(guān)(P=0.461;P=0.844)。2.4Survivin高表達(dá)與HPV16/18感染及Bcl-2表達(dá)的相關(guān)性對175例宮頸組織SurvivinmRNA的表達(dá)率與高危型HPV16/18感染及Bcl-2的表達(dá)率進(jìn)行等級相關(guān)分析,結(jié)果表明SurvivinmRNA高表達(dá)與HPV16/18感染呈正相關(guān)(P<0.05),SurvivinmRNA高表達(dá)與Bcl-2呈正相關(guān)(P<0.05)。3單次感染中創(chuàng)新點(diǎn):自由基因?qū)嶒?yàn)宮頸癌的發(fā)生是一個多階段、多步驟的復(fù)雜過程,與多種癌基因和抑癌基因的表達(dá)、調(diào)控以及細(xì)胞凋亡有關(guān)。Bcl-2蛋白主要定位于細(xì)胞膜的線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,其生物學(xué)功能為延長細(xì)胞的生命周期并增強(qiáng)細(xì)胞對凋亡刺激因素的耐受性而達(dá)到抗凋亡的作用,是較肯定的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因。它在體內(nèi)以二聚體形式發(fā)揮作用,若形成同聚體則抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2過度表達(dá)抑制細(xì)胞的凋亡,使受損的細(xì)胞獲得永生性,并在增殖基因、生長抑制基因的共同調(diào)控下可發(fā)展為腫瘤。本研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2在正常宮頸組織上皮細(xì)胞內(nèi)(對照組)陽性率為5.0%,在CIN組中陽性率上升為39.2%,在宮頸癌組中達(dá)到70.4%,3組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。隨著宮頸癌組織分化程度和臨床分期的增加,Bcl-2陽性率有顯著增加(P<0.01),表明Bcl-2與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系,其陽性與腫瘤的增殖、浸潤相關(guān)。這與鄧志敏等報道相一致。在宮頸非典型增生向?qū)m頸癌演變的過程中,病毒整合是一重要機(jī)制,病毒的整合導(dǎo)致病毒基因表達(dá)的失調(diào)、宿主基因的不穩(wěn)定、甚至細(xì)胞癌基因的激活,從而決定了細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。高危型HPV主要為16、18等亞型,其與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,宮頸癌組的HPV16/18感染率顯著高于CIN組和對照組,CIN組亦顯著高于對照組。表明HPV16/18感染為宮頸癌發(fā)生發(fā)展的主要原因之一,其感染程度與宮頸病變程度相關(guān),因此積極預(yù)防及治療HPV感染對防治宮頸癌有重要意義。Survivin基因定位于17q25,主要通過直接抑制caspase-3和caspase-7的活性而阻斷細(xì)胞凋亡過程。Survivin基因只在胚胎中表達(dá),在成人已分化組織中呈低表達(dá)或不表達(dá),但在人類多種腫瘤中都有表達(dá),這一特點(diǎn)為腫瘤的早期診斷和基因治療提供了新的靶點(diǎn)。Saitoh等用NorthernBlotting方法發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)標(biāo)本中,SurvivinmRNA在宮頸癌中的表達(dá)水平是正常宮頸組織的2倍。本研究發(fā)現(xiàn)在對照組、CIN組和宮頸癌組中Survivin的表達(dá)率逐漸升高,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。組織分化惡性程度越高、腫瘤期別越高,Survivin的陽性表達(dá)率越高,且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,以上結(jié)果說明SurvivinmRNA的表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有密切相關(guān),它預(yù)示著腫瘤具有較高的侵襲性和不良預(yù)后。這與Kim等研究一致,提示Survivin可能通過抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖而在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。本研究中宮頸癌ⅡB期以上患者Survivin陽性率明顯增高(P=0.042),亦提示Survivin表達(dá)與此類患者的不良預(yù)后有關(guān),對臨床治療有指導(dǎo)意義。在本研究中尚未發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌與腺癌Survivin表達(dá)的差異(P=0.461),這可能與收集的宮頸腺癌樣本量相對較少有關(guān)。由于本研究資料收集時間僅2年,尚缺乏研究對象生存時間的隨訪資料,Survivin是否為宮頸癌預(yù)后的客觀指標(biāo)還有待深入研究。本研究還發(fā)現(xiàn)Survivin的表達(dá)和Bcl-2呈正相關(guān),其與HPV16/18感染亦呈正相關(guān),目前3者協(xié)同致病機(jī)制還不清楚?？赡苁荢urvivin基因所在的染色體不穩(wěn)定,此位點(diǎn)可能涉及t(14,18)易位,而導(dǎo)致Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄激活;另一方面,通過相似的啟動序列