緒論(醫(yī)學細胞生物學)課件

1新興職業(yè)學院張承建1新興職業(yè)學院第1章緒論第1章緒論3細胞:是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。細胞生物學(cellbiology)從細胞水平（整體、亞微結(jié)構(gòu)、分子）探討生命活動規(guī)律的科學。醫(yī)學細胞生物學(medicalcellbiology)：運用細胞生物學的理論和方法，研究人體的細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能等生命活動規(guī)律和人類疾病發(fā)生、發(fā)展及其防治的科學。3細胞:是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。第一節(jié)細胞學與細胞生物學

自然界千姿百態(tài)，生物包羅萬象，中學我們學習的是科普知識…現(xiàn)在我們是系統(tǒng)性深入學習，目的是為今后的醫(yī)學理論和實踐打下堅實基礎(chǔ)。1665年英國生物學家胡克發(fā)現(xiàn)了細胞，隨后學者們建立了傳統(tǒng)細胞學：研究細胞化學、組織學、形態(tài)結(jié)構(gòu)、及功能的學科?？茖W進步，設(shè)備發(fā)展，技術(shù)更新，各學科膠著滲透，致使細胞學研究發(fā)生了質(zhì)的改變。表現(xiàn)在整體到微觀、形態(tài)到功能、表象到本質(zhì)、臨床到機制等各個方面。細胞生物學是：應用現(xiàn)代物理化學、分子生物學方法技術(shù)，從細胞整體，顯微、到亞顯微和分子水平上研究細胞結(jié)構(gòu)、功能及生命活動規(guī)律的學科。其內(nèi)容包括質(zhì)膜、細胞質(zhì)和細胞核的結(jié)構(gòu)功能及其相互關(guān)系，細胞總體和動態(tài)的功能活動（生長、分裂、分化、生殖、遺傳等）以及這些相互關(guān)系和功能活動的分子基礎(chǔ)。2023/10/2第一節(jié)細胞學與細胞生物學自然界千姿百態(tài)，生物包羅

細胞生物學的重要性主要在于，細胞生物學和分子生物學之間；分子生物學和個體生物學之間；相互銜接相互滲透，它們之間的關(guān)系對今天的醫(yī)學，藥物學，生物化學等生命學科起著核心支柱，承上啟下的重要作用。

醫(yī)學細胞生物學：是應用細胞生物學的理論和方法，研究人體細胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能活動規(guī)律和人類疾病發(fā)生，發(fā)展及其防治的學科。2023/10/22023/8/2第二節(jié)、細胞生物學的發(fā)展史（五個階段）

一、萌芽階段

1590年荷蘭人發(fā)明顯微鏡

1665年英國人發(fā)現(xiàn)細胞

1673年——1677年發(fā)現(xiàn)一些細胞器結(jié)構(gòu)這一時期，設(shè)備和技術(shù)的發(fā)展緩慢，所以只是萌芽階段。二、學說建立階段1839年德國植物學家總結(jié)：一切生物由細胞組成，細胞是生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動的基本單位。1858年德國病理學家提出：機體的一切病理表現(xiàn)都給予細胞的損傷。以上的要點在：生物是細胞組成，是多細胞生物的基本單位。細胞是生物的結(jié)構(gòu)和功能單位。細胞來源與細胞。三、經(jīng)典細胞學階段主要是原生質(zhì)學說的建立，發(fā)現(xiàn)了各種細胞器和觀察到多種細胞生理現(xiàn)象，如受精、分裂、分化等現(xiàn)象，人們的認識達到了新的水平。

2023/10/2第二節(jié)、細胞生物學的發(fā)展史（五個階段）一、萌芽階段7對象：細胞（cell，生命活動的基本單位）構(gòu)成生物有機體代謝與功能生物有機體生長發(fā)育遺傳（遺傳全能性）細胞是基本單位一、細胞生物學研究的內(nèi)容7對象：細胞（cell，生命活動的基本單位）構(gòu)成生物有機體細研究水平：

細胞整體、亞微結(jié)構(gòu)、分子水平利用光鏡描述細胞的結(jié)構(gòu)利用電鏡或掃描探針探清細胞的亞微或分子結(jié)構(gòu)

形態(tài)方面研究任務：研究水平：利用光鏡描述細胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)方面研究任務：9二、細胞生物學的發(fā)展歷史(一)細胞的發(fā)現(xiàn)和細胞學說的創(chuàng)立(四)分子生物學的發(fā)展(二)經(jīng)典細胞學的發(fā)展(三)實驗細胞學的發(fā)展9二、細胞生物學的發(fā)展歷史(一)細胞的發(fā)現(xiàn)和細胞學說的創(chuàng)立(10細胞學說細胞學說（celltheory）：細胞是一切生物體構(gòu)造和功能上的基本單位，整個機體是由細胞和細胞的產(chǎn)物所組成。10細胞學說細胞學說（celltheory）：細胞是一切111112三、細胞生物學的主要分支學科

細胞形態(tài)學（形態(tài)和功能）

細胞化學（化學成分定位、分布及生理功能）

細胞生理學（生命活動規(guī)律）細胞遺傳學（染色體的結(jié)構(gòu)功能）分子細胞學（基因組的結(jié)構(gòu)和功能）細胞社會學（細胞識別、通訊及相互作用）12三、細胞生物學的主要分支學科細胞形態(tài)學（形態(tài)和功能）13一、細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)研究技術(shù)（一）細胞顯微結(jié)構(gòu)研究的技術(shù)與方法第二節(jié)細胞生物學研究方法概述光學放大系統(tǒng)照明系統(tǒng)機械和支架系統(tǒng)顯微結(jié)構(gòu)13一、細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)研究技術(shù)（一14尼康E-600顯微鏡1.復式顯微鏡：單筒目鏡、雙瞳目鏡最常用14尼康E-600顯微鏡1.復式顯微鏡：2.暗視野顯微鏡：

利用被檢物所反射或衍射的光線來觀察標本

觀察細菌、原生動物或提純的細胞器等顆粒物質(zhì)。2.暗視野顯微鏡：16

細胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質(zhì)進行定性和定量研究的工具之一。3.熒光顯微鏡尼康E800熒光DIC顯微鏡16細胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒17線粒體干細胞皮膚微管17線粒體干細胞皮膚微管4.相差顯微鏡：

利用光線通過不同物質(zhì)所形成的反差來觀察標本觀察活細胞的細微結(jié)構(gòu)和變化。4.相差顯微鏡：鏈球菌形態(tài)鏈球菌形態(tài)20萊卡倒置顯微鏡

組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，具有相差物鏡。5.倒置顯微鏡20萊卡倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與216.共聚焦顯微鏡

無法用眼睛直接觀察，只能用探測器收集每個像素點的信號，再通過軟件重構(gòu)圖像。分辨率比普通顯微鏡有少量提高。216.共聚焦顯微鏡無法用眼睛直接觀察，只能用探測器22

電子顯微鏡與光學顯微鏡的成像原理基本一樣，所不同的是前者用電子束作光源，用電磁場作透鏡。另外，由于電子束的穿透力很弱，因此用于電鏡的標本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。這種切片需要用超薄切片機制作。電子顯微鏡的放大倍數(shù)最高可達近百萬倍，由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。（二）細胞超微結(jié)構(gòu)研究的技術(shù)與方法常用電子顯微鏡和X射線衍射儀。22電子顯微鏡與光學顯微鏡的成像原理基本一樣，所不同23JEM-1011透射電子顯微鏡

在光學顯微鏡下無法看清小于0.2μm的細微結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)或超微結(jié)構(gòu)。要想看清這些結(jié)構(gòu)，就必須選擇波長更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。1932年Ruska發(fā)明了以電子束為光源的透射電子顯微鏡，電子束的波長要比可見光和紫外光短得多，并且電子束的波長與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說電壓越高波長越短。目前TEM的分辨力可達0.2nm。1.透射電子顯微鏡23JEM-1011透射電子顯微鏡在光學顯微鏡下無內(nèi)質(zhì)網(wǎng)透射電鏡圖內(nèi)質(zhì)網(wǎng)透射電鏡圖25

于20世紀60年代問世，用來觀察標本的表面結(jié)構(gòu)。其工作原理是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與電子束入射角有關(guān)，也就是說與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級電子由探測體收集，并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘枺俳?jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻晒馄辽想娮邮膹姸?，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標本的表面結(jié)構(gòu)。為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。2.掃描電子顯微鏡（scanningelectronmicroscope，SEM）25于20世紀60年代問世，用來觀察標本的表面結(jié)構(gòu)。26JEOL掃描電子顯微鏡26JEOL掃描電子顯微鏡人類血細胞SEM照片人類血細胞SEM照片（1）組織分離法（2）細胞培養(yǎng)法（3）超薄切片法（4）懸滴-復染法與噴鍍法（5）冷凍蝕刻復型法（6）放射性核素電競自顯影技術(shù)3.電鏡樣品的制備（1）組織分離法3.電鏡樣品的制備二、細胞培養(yǎng)及相關(guān)技術(shù)（一）體外細胞培養(yǎng)技術(shù)（二）細胞融合技術(shù)（三）細胞顯微操作技術(shù)二、細胞培養(yǎng)及相關(guān)技術(shù)（一）體外細胞培養(yǎng)技術(shù)（二）細胞融合技30三、細胞及亞細胞組分的分離和純化技術(shù)（一）細胞化學免疫熒光技術(shù)細胞化學:

在保持細胞結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，利用某些化學物質(zhì)可與細胞內(nèi)某些成分發(fā)生化學反應，在局部形成有色沉淀物的原理，以示待查物質(zhì)存在于細胞中的部位。例如：Feulgen法——顯示DNA30三、細胞及亞細胞組分的分離和純化技術(shù)31免疫細胞化學（immunocytochemistry）:

根據(jù)免疫學原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對抗原進行定位測定的技術(shù)?？乖捍蠓肿踊蚺c大分子相結(jié)合的小分子?？贵w：由漿細胞針對特定的抗原分泌的γ球蛋白。

如果將抗體結(jié)合上標記物，再與組織中的抗原發(fā)生反應，即可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于組織中的部位。31免疫細胞化學（immunocytochemistry）:32（二）細胞顯微分光光度測定技術(shù)根據(jù)細胞內(nèi)某些物質(zhì)對光譜吸收的原理，用以測定這些物質(zhì)如核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子在細胞內(nèi)的含量。吸收光譜的波長：230～700nmFeulgen染色后的DNA吸收的波長：546nm細胞顯微分光光度測定技術(shù)：定位和定量32（二）細胞顯微分光光度測定技術(shù)33（三）流式細胞計量術(shù)（FCM）用氬離子激光發(fā)出的激光束為激發(fā)光，通過調(diào)節(jié)液壓，迫使懸浮的細胞排成單列，按重力方向流動，當細胞通過激光束檢測區(qū)時，細胞被激光束照射而向各個方向發(fā)出散射光，若經(jīng)熒光染色的細胞，就會發(fā)出一定強度的熒光，儀器的檢測系統(tǒng)，就可逐個對細胞的散射光和熒光強度進行測定，并將光信號轉(zhuǎn)變成電信號，由電子控制臺放大和顯示。33（三）流式細胞計量術(shù)（FCM）34測量速度：5000個細胞/s＋8個相關(guān)參數(shù)分選出細胞純度：90～99%檢測的參數(shù)：細胞大小、體積、DNA、RNA、總蛋白含量、表面抗原、受體、染色體等應用：細胞動力學、免疫學、體細胞學、腫瘤的診斷和治療等。流式細胞儀特點34測量速度：5000個細胞/s＋8個相關(guān)參數(shù)流式細胞儀35353636373738（四）放射自顯影術(shù)（五）細胞器的分離與提純技術(shù)38（四）放射自顯影術(shù)39四、細胞分子生物學技術(shù)（一）細胞原位分子雜交技術(shù)分子雜交的基本原理：堿基的互補配對原位雜交（insituhybridization）：將細胞或組織切片固定在載玻片上，保持細胞中的DNA和RNA在原位置條件下，與標記的DNA或RNA分子探針進行原位雜交，通過放射性自顯影或顯微鏡可探測到待查材料中被雜交的分子。直接進行基因定位、定量分析。39四、細胞分子生物學技術(shù)分子雜交的基本原理：堿基的互補配對40原位雜交的特點:雜交在顯微鏡載玻片上中期染色體標本上進行。所謂原位即指標本上DNA原位變性，在利用放射性或非放射性標記的已知核酸探針雜交后，通過放射自顯影或非放射性檢測體系來檢測染色體上特異DNA或RNA順序，可用放射性顆粒在某條染色體的區(qū)帶出現(xiàn)的最高頻率或熒光的強弱來確定探針的位置，從而進行準確的基因定位。原位雜交必須在已知探針的情況下方可進行，而在未知致病基因時，則無法進行基因定位。40原位雜交的特點:雜交在顯微鏡載玻片上中期染色體標本上進行41熒光原位雜交（florescenceinsituhybridization,FISH）

是一種非放射性原位雜交方法。用特殊熒光素標記核酸（DNA）探針，可在染色體、細胞和組織切片標本上進行DNA雜交，對檢測細胞內(nèi)DNA或RNA的特定序列存在與否最為有效。探針不是放射性的而是將熒光染料與抗體蛋白結(jié)合進行檢測。它們具有高度親和力，有與放射性探針相同或更高的分辯率。41熒光原位雜交42固定生物樣本并準備顯微鏡涂片預先調(diào)節(jié)顯微鏡標記探針對目標DNA進行變性進行原位雜交和雜交后洗滌免疫細胞化學染色顯微鏡觀察熒光原位雜交（FISH）實驗程序（是一種多步驟的實驗方法）42熒光原位雜交（FISH）實驗程序43現(xiàn)已可用不同的熒光染料同時進行多重原位雜交，顯示出不同的熒光色澤。這種多色FISH技術(shù)近年來發(fā)展迅速，已成為基因定位作圖和醫(yī)學診斷的重要手段。1992年運用這種策略已能在中期染色體和間期細胞同時檢測7個探針?？茖W家們的目標是實現(xiàn)24種不同顏色來觀察22條常染色體和X、Y染色體。43現(xiàn)已可用不同的熒光染料同時進行多重原位雜交，顯示出不同的44912t(9q/12q)t(9p/12p)利用FISH技術(shù)檢測染色體易位44912t(9q/12q)t(9p/12p)利用FISH技454546DNA探針技術(shù)1.是以已知DNA片段作為探針與待測樣品DNA或其片段進行核酸分子雜交，判斷二者同源性程度。2.根據(jù)雜交結(jié)果就可以分析待測DNA中有無該基因或該基因是否發(fā)生了變化，從而作出診斷。3.DNA探針（基因探針）是一段與目的基因相互補的核酸序列（DNA或RNA），其長度不一，可為完整基因亦可為其一部分。4.探針：單鏈，帶有容易被追蹤和檢測出來的標記。5.寡核苷酸探針：單堿基改變的檢測。46DNA探針技術(shù)47目前可孕前診斷的單基因病

Prader-Willi綜合征(PWS)、性畸形(SRY基因診斷)、X染色體連鎖魚鱗病、Duchenne肌營養(yǎng)不良（DMD）、脆性X染色體綜合癥、α地中海貧血、β地中海貧血、脊髓性肌萎縮、肯尼迪氏綜合征及雄激素受體基因異常所致疾病、Ⅱ型粘多糖貯積癥、Marfan綜合征、血友病、視網(wǎng)膜母細胞瘤、無精子癥相關(guān)基因缺失診斷、成骨發(fā)育不全、Huntington舞蹈癥、Kallmann綜合征、遺傳性視神經(jīng)萎縮、軟骨發(fā)育不全、苯丙酮尿癥、Wilson氏病、結(jié)節(jié)性硬化癥等。47目前可孕前診斷的單基因病48聚合酶鏈反應（PCR）：

利用耐熱的DNA聚合酶,以一對與模板DNA互補的寡核苷酸為引物，在體外模擬體內(nèi)的DNA復制過程，即進行變性、退火和延伸三個階段（循環(huán)30次），使目的DNA擴增到約106個拷貝，既100百萬倍。優(yōu)點：快速、簡便、準確、可靠、經(jīng)濟、特異性強等。擴增倍數(shù)=2n（n：擴增周期）PCR模板DNA取材：細胞、發(fā)根、精斑、血斑、已制備成的標本、木乃伊（二）聚合酶鏈反應技術(shù)48聚合酶鏈反應（PCR）：（二）聚合酶鏈反應技術(shù)49引物：能與模板DNA兩條鏈上的各一段序列互補的寡核苷酸（15～20bp）上游序列：

5′TTTGGAGGCAAGCAAGCAG3′PGC-1基因引物序列：擴增的DNA片段長度：508bp5′TATTTAGGGTTTTGCCAAGG3′下游序列：49引物：能與模板DNA兩條鏈上的各一段序列互補的寡核苷酸（50500bpMarkerPCR產(chǎn)物