緒論(醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué))課件

1新興職業(yè)學(xué)院張承建1新興職業(yè)學(xué)院第1章緒論第1章緒論3細(xì)胞:是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。細(xì)胞生物學(xué)(cellbiology)從細(xì)胞水平（整體、亞微結(jié)構(gòu)、分子）探討生命活動規(guī)律的科學(xué)。醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)(medicalcellbiology)：運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)的理論和方法，研究人體的細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能等生命活動規(guī)律和人類疾病發(fā)生、發(fā)展及其防治的科學(xué)。3細(xì)胞:是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。第一節(jié)細(xì)胞學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)

自然界千姿百態(tài)，生物包羅萬象，中學(xué)我們學(xué)習(xí)的是科普知識…現(xiàn)在我們是系統(tǒng)性深入學(xué)習(xí)，目的是為今后的醫(yī)學(xué)理論和實(shí)踐打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。1665年英國生物學(xué)家胡克發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞，隨后學(xué)者們建立了傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)：研究細(xì)胞化學(xué)、組織學(xué)、形態(tài)結(jié)構(gòu)、及功能的學(xué)科?？茖W(xué)進(jìn)步，設(shè)備發(fā)展，技術(shù)更新，各學(xué)科膠著滲透，致使細(xì)胞學(xué)研究發(fā)生了質(zhì)的改變。表現(xiàn)在整體到微觀、形態(tài)到功能、表象到本質(zhì)、臨床到機(jī)制等各個方面。細(xì)胞生物學(xué)是：應(yīng)用現(xiàn)代物理化學(xué)、分子生物學(xué)方法技術(shù)，從細(xì)胞整體，顯微、到亞顯微和分子水平上研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能及生命活動規(guī)律的學(xué)科。其內(nèi)容包括質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)功能及其相互關(guān)系，細(xì)胞總體和動態(tài)的功能活動（生長、分裂、分化、生殖、遺傳等）以及這些相互關(guān)系和功能活動的分子基礎(chǔ)。2023/10/2第一節(jié)細(xì)胞學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)自然界千姿百態(tài)，生物包羅

細(xì)胞生物學(xué)的重要性主要在于，細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)之間；分子生物學(xué)和個體生物學(xué)之間；相互銜接相互滲透，它們之間的關(guān)系對今天的醫(yī)學(xué)，藥物學(xué)，生物化學(xué)等生命學(xué)科起著核心支柱，承上啟下的重要作用。

醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)：是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)的理論和方法，研究人體細(xì)胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能活動規(guī)律和人類疾病發(fā)生，發(fā)展及其防治的學(xué)科。2023/10/22023/8/2第二節(jié)、細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展史（五個階段）

一、萌芽階段

1590年荷蘭人發(fā)明顯微鏡

1665年英國人發(fā)現(xiàn)細(xì)胞

1673年——1677年發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞器結(jié)構(gòu)這一時(shí)期，設(shè)備和技術(shù)的發(fā)展緩慢，所以只是萌芽階段。二、學(xué)說建立階段1839年德國植物學(xué)家總結(jié)：一切生物由細(xì)胞組成，細(xì)胞是生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動的基本單位。1858年德國病理學(xué)家提出：機(jī)體的一切病理表現(xiàn)都給予細(xì)胞的損傷。以上的要點(diǎn)在：生物是細(xì)胞組成，是多細(xì)胞生物的基本單位。細(xì)胞是生物的結(jié)構(gòu)和功能單位。細(xì)胞來源與細(xì)胞。三、經(jīng)典細(xì)胞學(xué)階段主要是原生質(zhì)學(xué)說的建立，發(fā)現(xiàn)了各種細(xì)胞器和觀察到多種細(xì)胞生理現(xiàn)象，如受精、分裂、分化等現(xiàn)象，人們的認(rèn)識達(dá)到了新的水平。

2023/10/2第二節(jié)、細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展史（五個階段）一、萌芽階段7對象：細(xì)胞（cell，生命活動的基本單位）構(gòu)成生物有機(jī)體代謝與功能生物有機(jī)體生長發(fā)育遺傳（遺傳全能性）細(xì)胞是基本單位一、細(xì)胞生物學(xué)研究的內(nèi)容7對象：細(xì)胞（cell，生命活動的基本單位）構(gòu)成生物有機(jī)體細(xì)研究水平：

細(xì)胞整體、亞微結(jié)構(gòu)、分子水平利用光鏡描述細(xì)胞的結(jié)構(gòu)利用電鏡或掃描探針探清細(xì)胞的亞微或分子結(jié)構(gòu)

形態(tài)方面研究任務(wù)：研究水平：利用光鏡描述細(xì)胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)方面研究任務(wù)：9二、細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展歷史(一)細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和細(xì)胞學(xué)說的創(chuàng)立(四)分子生物學(xué)的發(fā)展(二)經(jīng)典細(xì)胞學(xué)的發(fā)展(三)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞學(xué)的發(fā)展9二、細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展歷史(一)細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和細(xì)胞學(xué)說的創(chuàng)立(10細(xì)胞學(xué)說細(xì)胞學(xué)說（celltheory）：細(xì)胞是一切生物體構(gòu)造和功能上的基本單位，整個機(jī)體是由細(xì)胞和細(xì)胞的產(chǎn)物所組成。10細(xì)胞學(xué)說細(xì)胞學(xué)說（celltheory）：細(xì)胞是一切111112三、細(xì)胞生物學(xué)的主要分支學(xué)科

細(xì)胞形態(tài)學(xué)（形態(tài)和功能）

細(xì)胞化學(xué)（化學(xué)成分定位、分布及生理功能）

細(xì)胞生理學(xué)（生命活動規(guī)律）細(xì)胞遺傳學(xué)（染色體的結(jié)構(gòu)功能）分子細(xì)胞學(xué)（基因組的結(jié)構(gòu)和功能）細(xì)胞社會學(xué)（細(xì)胞識別、通訊及相互作用）12三、細(xì)胞生物學(xué)的主要分支學(xué)科細(xì)胞形態(tài)學(xué)（形態(tài)和功能）13一、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)研究技術(shù)（一）細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)研究的技術(shù)與方法第二節(jié)細(xì)胞生物學(xué)研究方法概述光學(xué)放大系統(tǒng)照明系統(tǒng)機(jī)械和支架系統(tǒng)顯微結(jié)構(gòu)13一、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)研究技術(shù)（一14尼康E-600顯微鏡1.復(fù)式顯微鏡：單筒目鏡、雙瞳目鏡最常用14尼康E-600顯微鏡1.復(fù)式顯微鏡：2.暗視野顯微鏡：

利用被檢物所反射或衍射的光線來觀察標(biāo)本

觀察細(xì)菌、原生動物或提純的細(xì)胞器等顆粒物質(zhì)。2.暗視野顯微鏡：16

細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。3.熒光顯微鏡尼康E800熒光DIC顯微鏡16細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒17線粒體干細(xì)胞皮膚微管17線粒體干細(xì)胞皮膚微管4.相差顯微鏡：

利用光線通過不同物質(zhì)所形成的反差來觀察標(biāo)本觀察活細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)和變化。4.相差顯微鏡：鏈球菌形態(tài)鏈球菌形態(tài)20萊卡倒置顯微鏡

組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，具有相差物鏡。5.倒置顯微鏡20萊卡倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與216.共聚焦顯微鏡

無法用眼睛直接觀察，只能用探測器收集每個像素點(diǎn)的信號，再通過軟件重構(gòu)圖像。分辨率比普通顯微鏡有少量提高。216.共聚焦顯微鏡無法用眼睛直接觀察，只能用探測器22

電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的成像原理基本一樣，所不同的是前者用電子束作光源，用電磁場作透鏡。另外，由于電子束的穿透力很弱，因此用于電鏡的標(biāo)本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。這種切片需要用超薄切片機(jī)制作。電子顯微鏡的放大倍數(shù)最高可達(dá)近百萬倍，由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。（二）細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)研究的技術(shù)與方法常用電子顯微鏡和X射線衍射儀。22電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的成像原理基本一樣，所不同23JEM-1011透射電子顯微鏡

在光學(xué)顯微鏡下無法看清小于0.2μm的細(xì)微結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)或超微結(jié)構(gòu)。要想看清這些結(jié)構(gòu)，就必須選擇波長更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。1932年Ruska發(fā)明了以電子束為光源的透射電子顯微鏡，電子束的波長要比可見光和紫外光短得多，并且電子束的波長與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說電壓越高波長越短。目前TEM的分辨力可達(dá)0.2nm。1.透射電子顯微鏡23JEM-1011透射電子顯微鏡在光學(xué)顯微鏡下無內(nèi)質(zhì)網(wǎng)透射電鏡圖內(nèi)質(zhì)網(wǎng)透射電鏡圖25

于20世紀(jì)60年代問世，用來觀察標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。其工作原理是用一束極細(xì)的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與電子束入射角有關(guān)，也就是說與樣品的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)，次級電子由探測體收集，并在那里被閃爍器轉(zhuǎn)變?yōu)楣庑盘?，再?jīng)光電倍增管和放大器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘杹砜刂茻晒馄辽想娮邮膹?qiáng)度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。為了使標(biāo)本表面發(fā)射出次級電子，標(biāo)本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。2.掃描電子顯微鏡（scanningelectronmicroscope，SEM）25于20世紀(jì)60年代問世，用來觀察標(biāo)本的表面結(jié)構(gòu)。26JEOL掃描電子顯微鏡26JEOL掃描電子顯微鏡人類血細(xì)胞SEM照片人類血細(xì)胞SEM照片（1）組織分離法（2）細(xì)胞培養(yǎng)法（3）超薄切片法（4）懸滴-復(fù)染法與噴鍍法（5）冷凍蝕刻復(fù)型法（6）放射性核素電競自顯影技術(shù)3.電鏡樣品的制備（1）組織分離法3.電鏡樣品的制備二、細(xì)胞培養(yǎng)及相關(guān)技術(shù)（一）體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（二）細(xì)胞融合技術(shù)（三）細(xì)胞顯微操作技術(shù)二、細(xì)胞培養(yǎng)及相關(guān)技術(shù)（一）體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（二）細(xì)胞融合技30三、細(xì)胞及亞細(xì)胞組分的分離和純化技術(shù)（一）細(xì)胞化學(xué)免疫熒光技術(shù)細(xì)胞化學(xué):

在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，利用某些化學(xué)物質(zhì)可與細(xì)胞內(nèi)某些成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，在局部形成有色沉淀物的原理，以示待查物質(zhì)存在于細(xì)胞中的部位。例如：Feulgen法——顯示DNA30三、細(xì)胞及亞細(xì)胞組分的分離和純化技術(shù)31免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry）:

根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對抗原進(jìn)行定位測定的技術(shù)?？乖捍蠓肿踊蚺c大分子相結(jié)合的小分子?？贵w：由漿細(xì)胞針對特定的抗原分泌的γ球蛋白。

如果將抗體結(jié)合上標(biāo)記物，再與組織中的抗原發(fā)生反應(yīng)，即可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于組織中的部位。31免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry）:32（二）細(xì)胞顯微分光光度測定技術(shù)根據(jù)細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對光譜吸收的原理，用以測定這些物質(zhì)如核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的含量。吸收光譜的波長：230～700nmFeulgen染色后的DNA吸收的波長：546nm細(xì)胞顯微分光光度測定技術(shù)：定位和定量32（二）細(xì)胞顯微分光光度測定技術(shù)33（三）流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)（FCM）用氬離子激光發(fā)出的激光束為激發(fā)光，通過調(diào)節(jié)液壓，迫使懸浮的細(xì)胞排成單列，按重力方向流動，當(dāng)細(xì)胞通過激光束檢測區(qū)時(shí)，細(xì)胞被激光束照射而向各個方向發(fā)出散射光，若經(jīng)熒光染色的細(xì)胞，就會發(fā)出一定強(qiáng)度的熒光，儀器的檢測系統(tǒng)，就可逐個對細(xì)胞的散射光和熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定，并將光信號轉(zhuǎn)變成電信號，由電子控制臺放大和顯示。33（三）流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)（FCM）34測量速度：5000個細(xì)胞/s＋8個相關(guān)參數(shù)分選出細(xì)胞純度：90～99%檢測的參數(shù)：細(xì)胞大小、體積、DNA、RNA、總蛋白含量、表面抗原、受體、染色體等應(yīng)用：細(xì)胞動力學(xué)、免疫學(xué)、體細(xì)胞學(xué)、腫瘤的診斷和治療等。流式細(xì)胞儀特點(diǎn)34測量速度：5000個細(xì)胞/s＋8個相關(guān)參數(shù)流式細(xì)胞儀35353636373738（四）放射自顯影術(shù)（五）細(xì)胞器的分離與提純技術(shù)38（四）放射自顯影術(shù)39四、細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)（一）細(xì)胞原位分子雜交技術(shù)分子雜交的基本原理：堿基的互補(bǔ)配對原位雜交（insituhybridization）：將細(xì)胞或組織切片固定在載玻片上，保持細(xì)胞中的DNA和RNA在原位置條件下，與標(biāo)記的DNA或RNA分子探針進(jìn)行原位雜交，通過放射性自顯影或顯微鏡可探測到待查材料中被雜交的分子。直接進(jìn)行基因定位、定量分析。39四、細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)分子雜交的基本原理：堿基的互補(bǔ)配對40原位雜交的特點(diǎn):雜交在顯微鏡載玻片上中期染色體標(biāo)本上進(jìn)行。所謂原位即指標(biāo)本上DNA原位變性，在利用放射性或非放射性標(biāo)記的已知核酸探針雜交后，通過放射自顯影或非放射性檢測體系來檢測染色體上特異DNA或RNA順序，可用放射性顆粒在某條染色體的區(qū)帶出現(xiàn)的最高頻率或熒光的強(qiáng)弱來確定探針的位置，從而進(jìn)行準(zhǔn)確的基因定位。原位雜交必須在已知探針的情況下方可進(jìn)行，而在未知致病基因時(shí)，則無法進(jìn)行基因定位。40原位雜交的特點(diǎn):雜交在顯微鏡載玻片上中期染色體標(biāo)本上進(jìn)行41熒光原位雜交（florescenceinsituhybridization,FISH）

是一種非放射性原位雜交方法。用特殊熒光素標(biāo)記核酸（DNA）探針，可在染色體、細(xì)胞和組織切片標(biāo)本上進(jìn)行DNA雜交，對檢測細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的特定序列存在與否最為有效。探針不是放射性的而是將熒光染料與抗體蛋白結(jié)合進(jìn)行檢測。它們具有高度親和力，有與放射性探針相同或更高的分辯率。41熒光原位雜交42固定生物樣本并準(zhǔn)備顯微鏡涂片預(yù)先調(diào)節(jié)顯微鏡標(biāo)記探針對目標(biāo)DNA進(jìn)行變性進(jìn)行原位雜交和雜交后洗滌免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯微鏡觀察熒光原位雜交（FISH）實(shí)驗(yàn)程序（是一種多步驟的實(shí)驗(yàn)方法）42熒光原位雜交（FISH）實(shí)驗(yàn)程序43現(xiàn)已可用不同的熒光染料同時(shí)進(jìn)行多重原位雜交，顯示出不同的熒光色澤。這種多色FISH技術(shù)近年來發(fā)展迅速，已成為基因定位作圖和醫(yī)學(xué)診斷的重要手段。1992年運(yùn)用這種策略已能在中期染色體和間期細(xì)胞同時(shí)檢測7個探針?？茖W(xué)家們的目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)24種不同顏色來觀察22條常染色體和X、Y染色體。43現(xiàn)已可用不同的熒光染料同時(shí)進(jìn)行多重原位雜交，顯示出不同的44912t(9q/12q)t(9p/12p)利用FISH技術(shù)檢測染色體易位44912t(9q/12q)t(9p/12p)利用FISH技454546DNA探針技術(shù)1.是以已知DNA片段作為探針與待測樣品DNA或其片段進(jìn)行核酸分子雜交，判斷二者同源性程度。2.根據(jù)雜交結(jié)果就可以分析待測DNA中有無該基因或該基因是否發(fā)生了變化，從而作出診斷。3.DNA探針（基因探針）是一段與目的基因相互補(bǔ)的核酸序列（DNA或RNA），其長度不一，可為完整基因亦可為其一部分。4.探針：單鏈，帶有容易被追蹤和檢測出來的標(biāo)記。5.寡核苷酸探針：單堿基改變的檢測。46DNA探針技術(shù)47目前可孕前診斷的單基因病

Prader-Willi綜合征(PWS)、性畸形(SRY基因診斷)、X染色體連鎖魚鱗病、Duchenne肌營養(yǎng)不良（DMD）、脆性X染色體綜合癥、α地中海貧血、β地中海貧血、脊髓性肌萎縮、肯尼迪氏綜合征及雄激素受體基因異常所致疾病、Ⅱ型粘多糖貯積癥、Marfan綜合征、血友病、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、無精子癥相關(guān)基因缺失診斷、成骨發(fā)育不全、Huntington舞蹈癥、Kallmann綜合征、遺傳性視神經(jīng)萎縮、軟骨發(fā)育不全、苯丙酮尿癥、Wilson氏病、結(jié)節(jié)性硬化癥等。47目前可孕前診斷的單基因病48聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：

利用耐熱的DNA聚合酶,以一對與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸為引物，在體外模擬體內(nèi)的DNA復(fù)制過程，即進(jìn)行變性、退火和延伸三個階段（循環(huán)30次），使目的DNA擴(kuò)增到約106個拷貝，既100百萬倍。優(yōu)點(diǎn)：快速、簡便、準(zhǔn)確、可靠、經(jīng)濟(jì)、特異性強(qiáng)等。擴(kuò)增倍數(shù)=2n（n：擴(kuò)增周期）PCR模板DNA取材：細(xì)胞、發(fā)根、精斑、血斑、已制備成的標(biāo)本、木乃伊（二）聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)48聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：（二）聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)49引物：能與模板DNA兩條鏈上的各一段序列互補(bǔ)的寡核苷酸（15～20bp）上游序列：

5′TTTGGAGGCAAGCAAGCAG3′PGC-1基因引物序列：擴(kuò)增的DNA片段長度：508bp5′TATTTAGGGTTTTGCCAAGG3′下游序列：49引物：能與模板DNA兩條鏈上的各一段序列互補(bǔ)的寡核苷酸（50500bpMarkerPCR產(chǎn)物