脾虛證與腦腸肽關系的形態(tài)學研究

脾虛證與腦腸肽關系的形態(tài)學研究

中醫(yī)的“脾”與循環(huán)系統(tǒng)密切相關。脾虛時，消化功能紊亂。而腦腸肽除通過腸神經系統(tǒng)和體液因素,還可在中樞水平調節(jié)胃腸功能。因此,研究脾虛證與腦腸肽的關系對探討脾虛證的本質有重要意義。本實驗在以前有關脾虛證與下丘腦SS、MOT、CCK含量關系的研究基礎上,首次從形態(tài)學角度就脾虛證與SS、MOT、CCK樣免疫反應神經元的關系進行探討。1動物分組、模型制備和免疫組化染色動物雄性SD大鼠25只,體重250±20g,本校實驗動物中心提供。藥物與試劑四君子湯、六味地黃湯均由本院中藥房提供,將藥物于清水中浸泡30分鐘,煮沸后,文火煎30分鐘,再濃縮至3g/ml濃度。利血平(1mg/ml)上海醫(yī)科大學紅旗制藥廠提供。兔抗大鼠SS、CCK、MOT抗體均由第二軍醫(yī)大學神經生物教研室提供;SABC試劑盒由博士德公司提供;DAB由Sigma公司提供。動物分組及脾虛動物模型的建立25只大鼠,隨機等分為5組:①正常對照組,每只每天股四頭肌注射生理鹽水0.2ml,同時灌服蒸餾水2ml,共14天;②脾虛模型Ⅰ組,每只每天股四頭肌注射利血平0.3mg/kg,并灌服蒸餾水2ml,共7天;③脾虛模型Ⅱ組,造模方法同脾虛模型Ⅰ組,連續(xù)處理14天;④四君子湯組和六味地黃湯組,在用利血平(用法用量同上)的同時分別灌服四君子湯和六味地黃湯2ml/d,共14天。標本收集脾虛模型Ⅰ組于造模第7日,其余各組于造模的第14日,大鼠側腦室注射0.6%秋水仙堿生理鹽水溶液20μl,存活24小時,禁食不禁水12小時,次日上午8時至9時,戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔麻醉后Bouin液灌注固定。取腦組織,后固定2小時,然后入30%蔗糖磷酸緩沖液至組織塊沉底。免疫組化染色腦組織于恒冷箱切片機做連續(xù)冠狀冰凍切片,片厚30μm。參考王平宇《大鼠腦讀片提要及圖譜》,從經髓紋彎斷開平面至經海馬初現平面隔2張取2張分別做CCK、SS染色;從髓紋下段消失平面至海馬齒狀回互包平面,隔3張取1張做MOT染色。用SABC法進行染色,SS、CCK、MOT抗血清工作濃度均為1∶2000。同時用正常兔血清和PBS分別取代3種抗血清做替代及空白對照,染色結果均為陰性。每只動物SS、CCK和MOT分別染6張切片,各選其中染色較好的4張切片在10×10倍數下計數每張切片在下丘腦的染色陽性細胞數,4張切片總數除以4為該只動物的數值。采用雙側t檢驗進行組間差異的比較。2cck神經元光鏡觀察和測定動物行為表現脾虛模型組動物在肌注利血平后的表現同文獻。四君子湯組與正常對照組比較無明顯差別。六味地黃湯組則與脾虛模型Ⅱ組改變類似。神經元染色形態(tài)學觀察:典型SS神經元胞體著深藍色,胞核不著色,胞體發(fā)出1~3個細長突起,有部分細胞的胞核被反應產物掩蓋。主要分布于室周核、室旁核、弓狀核、腹內側核、視交叉上核等核團。MOT神經元胞體內有顆粒狀藍色反應產物,胞核為空白或淡染區(qū)。胞體以圓形、橢圓形、梭形、蝌蚪形多見,部分細胞有1~2個細長突起,主要分布于室旁核和弓狀核,CCK神經元胞體內有藍色反應產物,胞核為空白或淡染區(qū)。胞體以圓形、橢圓形、梭形、蝌蚪形多見,部分細胞有1~2個細長突起。主要分布于室旁核與視上核,在室旁核CCK陽性胞體呈環(huán)狀排列。光鏡下SS、MOT、CCK神經元的測定見表1:與正常對照組相比,SS、MOT神經元數在脾虛模型Ⅰ組增加(P<0.01);脾虛模型Ⅱ組降低(P<0.01)。而CCK陽性神經元數在脾虛模型Ⅰ組和Ⅱ組均顯著增加(P<0.01)。四君子湯組無明顯改變,六味地黃湯組與脾虛模型Ⅱ組變化類似。3虛證和cck神經元的關系下丘腦的主要功能是調控內分泌系統(tǒng),同時它又是大腦皮層下自主神經系統(tǒng)的調控中樞,在控制全身內臟功能方面起著重要作用。中樞神經系統(tǒng)內有一部分具有分泌功能的細胞,它們兼有神經細胞和內分泌細胞的特性。它們可被電興奮,對高級神經中樞的神經沖動和神經遞質起反應,同時它們又具有分泌功能,能合成激素性物質,并將這些神經激素釋放入血,對其它部位發(fā)揮生理效應。神經內分泌細胞的發(fā)現打破了神經系統(tǒng)和內分泌系統(tǒng)不可逾越的概念。正常條件下中樞神經系統(tǒng)中絕大多數神經肽在神經元胞體中的含量極少,需用秋水仙素破壞軸突的微管系統(tǒng),阻斷軸漿運輸,使神經肽集積于神經元胞體中,免疫組織化學技術才能顯示它。有關脾虛證與下丘腦SS、MOT和CCK神經元關系的研究尚未見報道。脾虛證與SS神經元的關系SS神經元胞體主要位于視前區(qū)、下丘腦第三腦室前部室周區(qū)、弓狀核、室旁核內側小細胞部、視交叉上核及腹內側核等,本實驗顯示,SS神經元的分布與有關文獻報道一致。脾虛早期SS神經元數顯著增加,表明參與SS合成的神經元數增加,即有部分在正常情況下未參與激素合成的細胞在脾虛早期開始合成SS,脾虛后期SS陽性細胞數下降,表明參與激素合成細胞減少,即有部分細胞的合成功能被抑制。我們前文觀察到SS在下丘腦含量脾虛早期升高,脾虛晚期減少可能與此有關。脾虛證與MOT神經元的關系本實驗顯示,MOT神經元主要分布于視旁核與弓狀核,與HarlanRE報道一致。脾虛早期MOT神經元數升高,說明參與合成的神經元數增多,脾虛后期,MOT神經元數下降,說明參與合成的神經元數減少,這可能是我們以前研究所觀察的MOT在下丘腦含量脾虛早期升高,脾虛晚期下降的原因之一。脾虛證與CCK神經元的關系CCK神經元為大細胞或小細胞,主要分布于室旁核、視上核、室周核及室交叉上核等。本實驗顯示的CCK神經元的分布與有關文獻報道一致。脾虛早期、晚期CCK神經元數均顯著增高,說明參與合成的神經元數增加,這也是與我們以前觀察到的脾虛早期、晚期下丘腦CCK含量均增加相符合的。李澤桂研究發(fā)現,燙傷應激大鼠下丘腦CCK增加,相應室旁核CCK免疫反應性細胞的平均總面積大于對照組,第三腦室室管膜CCK免疫反應性細胞數增多,與本研究的結果類似。四君子湯預防性治療組SS、MOT和CCK神經元細胞數均無明顯變化,說明四君子湯對該三種神經元的合成功能具有調整作用。六味地黃湯組與脾虛Ⅱ組改變類似,說明六味地黃湯對這三種神經內分泌細胞的合成功能無調整作用。以方測證表明該脾虛動物模型是可信的。同時也為闡明四君子湯的健“脾”作用機理提供了實驗依據。綜上所述,脾虛造模早期下丘腦參與SS、MOT和CCK合成的神經元均增多,脾虛造模晚期下丘腦參與SS和MOT合成的神經元數減