hiv感染的血清學(xué)檢測課件

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HIV感染的血清學(xué)檢測2內(nèi)容HIV抗體檢測：HIV抗體篩查檢測HIV確認實驗HIVP24抗原檢測：3HIV抗體檢測全國艾滋病檢測技術(shù)標準NationalGuidelineforDetectionofHIV/AIDS〔2004年版〕4HIV抗體檢測可用于監(jiān)測、診斷、血液篩查：以監(jiān)測為目的的檢測是為了解不同人群HIV感染率及其變化趨勢而進行的檢測，檢測的人群包括各類高危人群和一般人群。以診斷為目的的檢測是為了確定個體HIV感染狀況而進行的檢測，包括臨床檢測和自愿咨詢檢測、術(shù)前檢測、根據(jù)特殊需要進行的體檢等。以血液篩查為目的的檢測是為了防止輸血傳播HIV而進行的檢測，包括獻血員篩查和原料血漿篩查。HIV抗體檢測分為篩查試驗〔包括初篩和復(fù)檢〕和確認試驗5

HIV抗體試劑盒進展代次抗原方法 特異性檢測檢測時間 1全病毒間接IgG抗體HIV-1

>2個月 2重組或多肽間接IgG抗體HIV-1/-2

3-4周 3重組+多肽夾心IgM/IgG抗體4-7天HIV-1/-2/-O 4抗原+抗體夾心 IgM/IgG抗體抗原5pgHIV-1/-2/-Op24抗原6

HIV抗體檢測篩查試驗7HIV抗體篩查檢測程序 篩查、復(fù)檢、確認原理 酶聯(lián)免疫、凝集、層析標本 血液、唾液、尿液、組織液產(chǎn)品 ELISA、快速、簡單8篩查試劑要求HIV?混合型 國家SDA生物診斷試劑注冊批準批檢合格臨床評估質(zhì)量優(yōu)良9篩查方法：常用的篩查方法是酶聯(lián)免疫試驗〔ELISA〕快速檢測〔RT〕及其它檢測(1)明膠顆粒凝集試驗(PA)(2)斑點EIA或稱斑點ELISA(dot-EIA)(3)斑點免疫膠體金〔或膠體硒〕快速試驗(4)艾滋病唾液檢測卡尿液HIV抗體檢測10一、酶聯(lián)免疫試驗：ELISA

11包被抗原血中抗體與抗原反響顯色反響酶聯(lián)免疫法病毒溶解抗原、重組的衍生抗原、合成肽抗原酶聯(lián)HRP、AP或化學(xué)發(fā)光12〔一〕斑點EIA或稱斑點ELISA〔dot-EIA〕以硝酸纖維膜為載體，將HIV抗原滴在膜上成點狀，即為固相抗原。加血清樣品作用，以后步驟同ELISA。陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點。反響時間在10min以內(nèi)，使用抗原量少。二、快速診斷試劑13〔二〕免疫膠體金〔或膠體硒〕快速試驗與斑點EIA相似，也是以硝酸纖維膜為載體。區(qū)別在于不用酶標記抗體，而代之以紅色的膠體金〔或膠體硒〕A蛋白，用滲濾法作為洗滌方法。14穩(wěn)定，可室溫長期保存。試驗不需任何設(shè)備，迅速、簡便、特異性較好，敏感性約相當于中度敏感的ELISA，適用于應(yīng)急檢測、門診急診個體檢測。已有被SFDA批準注冊的進口試劑和國內(nèi)產(chǎn)品。一般可在10

30min內(nèi)判讀結(jié)果。免疫膠體硒快速試驗特點15樣品墊:參加血漿,血清或全血樣品.紅細胞在此遷移過程中被去除質(zhì)控條:固定的含捕捉硒標物的特異性試劑,不管樣品中有無被檢測物都應(yīng)出現(xiàn)紅色線條.控制測試結(jié)果的有效性病人條:固定的含特異性分析試劑,任何與硒標特異性試劑結(jié)合的分析復(fù)合物在此被結(jié)合固定,形成三文治結(jié)合物,肉眼可見的紅色線條說明有陽性反響連接物墊:含分析特異性試劑結(jié)合的硒標,為一種肉眼可見的紅色信號,被分析物和硒標特異性試劑在此反響結(jié)合16撕下所需的測試紙條數(shù),撕下外表保護膜17血清/血漿樣品加50ul樣品于樣品墊中15分鐘內(nèi)讀取結(jié)果18全血樣品加50ul樣品于樣品墊中手指血方法靜脈血方法加一滴緩沖液15分鐘內(nèi)讀取結(jié)果19病人條質(zhì)控條20本卷須知非EDTA抗凝的血漿樣品可能會得到不正確的結(jié)果反響條顏色深淺的程度與樣品中抗體的滴度沒有必然的聯(lián)系結(jié)果的判斷……21〔三〕艾滋病唾液檢測卡在硝酸纖維膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可同時檢測含在唾液中的HIV-1/HIV-2抗體，原理為酶免疫間接法。主要檢測唾液中的HIVIgA與IgG抗體，敏感性特異性與ELISA相近，可防止靜脈穿刺。但樣品預(yù)處理時間長且售價較高。以唾液為樣品測定HIV抗體的ELISA、免疫印跡法〔WB〕試劑已經(jīng)美國FDA批準。22〔四〕明膠顆粒凝集試驗〔PA〕PA是HIV血清抗體檢測的一種簡便方法，是將HIV抗原致敏明膠顆粒作為載體，與待檢樣品作用，混勻后保溫〔一般為室溫〕。當待檢樣品含有HIV抗體時，經(jīng)抗原致敏的明膠顆粒與抗體發(fā)生抗原-抗體反響，根據(jù)明膠顆粒在孔中的凝集情況判讀結(jié)果。PA試劑有兩種，HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA試劑〔AFDHIV-1/2PA〕，已經(jīng)我國食品藥品監(jiān)督管理局〔SFDA〕注冊批準；HIV-1、HIV-2抗原分別致敏的PA試劑〔SERODIA-HIV-1/2〕可初步區(qū)分HIV-1型和HIV-2型，目前我國尚未引進。23

尿液測定采樣優(yōu)點，尤其對吸毒者標本機理：IgA為主，IgG少量HIV-1型抗體陽性結(jié)果務(wù)必用血清學(xué)檢測 24快速試劑的應(yīng)用偏遠地區(qū)急診臨床〔高?！陈殬I(yè)暴露臨產(chǎn)25結(jié)果報告：對呈陰性反響的樣品，可由實施檢測的實驗室出具HIV抗體陰性報告。對呈陽性反響的樣品，須進行復(fù)檢，不能出陽性報告。復(fù)檢試驗：對初篩呈陽性反響的樣品用原有試劑和另外一種不同原理或不同廠家的篩查試劑重復(fù)檢測。如果兩種試劑復(fù)測均呈陰性反響，那么報告HIV抗體陰性；如均呈陽性反響，或一陰一陽，需送艾滋病確認實驗室進行確認。對初篩試驗呈陽性反響者不能出陽性報告，可出具“HIV抗體待復(fù)查〞報告。26初篩試驗呈陽性反響樣品的轉(zhuǎn)送：填寫“HIV抗體待復(fù)測送檢單〞，經(jīng)1名檢驗人員和1名具有中級以上技術(shù)職稱的人員審核簽字。送當?shù)匕滩『Y查中心實驗室，再轉(zhuǎn)送艾滋病確認實驗室，或在本實驗室復(fù)檢后直接送確認實驗室。對篩查陰性和陽性者，均需做好檢測后咨詢。27樣本初篩檢測一陰一陽均陽性反應(yīng)陰性報告送確認實驗室確認重復(fù)檢測陰性報告均陰性反應(yīng)陽性反應(yīng)原有試劑＋另一種原理初篩試劑用初篩試劑陰性反應(yīng)HIV抗體初篩檢測流程圖28初篩試驗結(jié)果的報告對HIV抗體篩查試驗：“—〞“HIV抗體陰性〞報告〔可用附表“+〞不能出陽性報告，可出具“HIV抗體待復(fù)查〞報告29對HIV抗體篩查試驗，呈陰性反響者可出具“HIV抗體陰性〞報告30對初篩試驗呈陽性反響者不能出陽性報告，可出具“HIV抗體待復(fù)查〞報告3132

HIV抗體檢測確認試驗33HIV抗體確認試驗確認試驗的試劑：必須是經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準、在有效期內(nèi)的試劑。確認試驗方法：包括免疫印跡試驗(WB)、條帶免疫試驗(LIATEKHIVⅢ)、放射免疫沉淀試驗(RIPA)及免疫熒光試驗(IFA)。國內(nèi)常用確實認試驗方法是WB。34蛋白印跡實驗〔WB〕 ——廣泛使用確實認實驗根本原理HIV全病毒抗原經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳,將分子量大小不等的HIV抗原蛋白帶別離開來,然后再把這些已經(jīng)別離的不同蛋白帶電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將此膜切割成條狀,每一條硝酸纖維素膜上均含有經(jīng)電泳別離過的HIV病毒抗原。35將待檢血清樣品加到硝酸纖維素膜上,恒溫震蕩,使其充分接觸反響,血清中假設(shè)含有抗HIV抗體,就會與膜條上的抗原帶相結(jié)合。參加酶偶聯(lián)的抗人IgG抗體和底物，即可使有反響的抗原-抗體結(jié)合帶呈現(xiàn)紫褐色,根據(jù)出現(xiàn)條帶情況判定結(jié)果。36蛋白質(zhì)抗原分子經(jīng)電泳分開血液中的抗體與抗原反響，形成不同的條帶WesternBlot37方法加血漿YYY洗加酶結(jié)合物(Ab-HRP)YYYYYYY洗加底物YYYYYY38其可檢測標本中針對HIV不同抗原的抗體，故被用做確認試劑。不同的研究機構(gòu)有不同的判定標準39WB結(jié)果判定標準無HIV-1特異性條帶２ENV或１ENV+p24CHINA無條帶1ENV+p24/p31FDA（USA）無條帶或只有P172ENV+GAG+POLWHO陰性陽性組織“不確定〞(±)：出現(xiàn)HIV-1特異性條帶，但帶型缺乏以 確認陽性，每三個月隨訪一次，共兩次， 仍屬可疑，判為陰性40HIV抗體確認實驗結(jié)果a強陽性對照（HIV-1和HIV-2）b弱陽性對照（HIV-1）c陰性對照d典型的HIV-2血清陽性反應(yīng)

abcdgp160gp120

p66p55p51gp41p39

p31P24p17血清對照HIV-2特異帶41不確定標本的處理原因 特異性和非特異性因素 標本種類，操作技術(shù)，感染時間， 指征把握等處理 隨訪〔注意一根條帶〕保存42試驗中應(yīng)注意的問題嚴格按照說明書操作和閱讀判斷結(jié)果典型帶型和顏色；強調(diào)env帶非典型全而淡、一根主要條帶、高危人群、不確定，等等特異性高，但也有漏檢核對、多種、操作技術(shù)43免疫印跡法〔WB，HIV-1/2混合型〕HIV-1陽性反響不確定反響出現(xiàn)HIV-2指示條帶報告HIV-1陽性不確定反響陽性反響陰性反響報告陰性每3個月隨訪1次，共2次，仍屬可疑，那么報告陰性；如隨訪期間HIV抗體出現(xiàn)陽性反響那么報告陽性。隨訪期間可根據(jù)需要，檢測病毒核酸和或P24抗原，作為輔助診斷。陰性反響報告陰性篩查試驗陽性反響樣品報告HIV-2血清學(xué)陽性免疫印跡法〔WB，HIV-2〕

圖2HIV抗體確認檢測流程44P24抗原檢測45窗口期<infectivity=>4thgen3rdgen=>

=>1st-2ndgenHIVantigenIgMabIgGabDetectionlimit<=window第一/二代試劑檢測IgG抗體，第三代試劑檢測IgG、IgM抗體,第四代試劑同時檢測IgG、IgM抗體和P24抗原使窗口期縮短。46

窗口期窗口期的決定因素初篩試劑質(zhì)量和測試技術(shù)機體免疫反響病毒特性窗口期無法防止47

P24抗原測定適用范圍HIV-1抗體不確定或窗口期的輔助診斷。HIV-1陽性母親所生嬰兒的鑒別診斷。第四代HIV-1抗原/抗體ELISA試劑檢測呈陽性反響，但HIV-1抗體確認陰性者的診斷。監(jiān)測病程進展和抗病毒治療效果。48檢測原理P24抗原的檢測通常是采用ELISA夾心法，抗體包被固相反響板孔底，參加待測血清，假設(shè)血清中含有P24抗原那么與包被抗體形成抗原-抗體復(fù)合物，再參加酶〔HRP〕標記的HIV-1抗體與抗原結(jié)合，加底物顯色，在酶標儀上讀結(jié)果。49為了提高檢測血清中P24抗原的敏感性，需先將血清中免疫復(fù)合物解離后再進行測定目前已開展了ICDP24抗原〔immun-complexdisassociate，免疫復(fù)合物解離，ICD〕測定試劑，用于HIV-1P24抗原測定。即使將復(fù)合物解離，敏感性提高，也只能在大約50%無病癥感染者中檢出P24抗原。50結(jié)果報告和解釋定性分析：1、HIV-1P24抗原的陽性結(jié)果必須經(jīng)過中和試驗確認。2、HIV-1P24抗原陽性僅作為HIV感染的輔助診斷依據(jù)，不能依此確診。3、HIV-1P24抗原陰性結(jié)果只表示在本試驗中無反響，不