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文檔簡介
一、實時熒光定量PCR原理〔一〕定義:在PCR反響體系中參加熒光基團(tuán),利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)展定量分析的方法。〔二〕實時原理1、常規(guī)PCR技術(shù):對PCR擴增反響的終點產(chǎn)物進(jìn)展定量和定性分析無法對起始模板準(zhǔn)確定量,無法對擴增反響實時檢測。2、實時定量PCR技術(shù):利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反響中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化,通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)展定量分析3、如何對起始模板定量?通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)展定量分析.4、幾個概念:〔1〕擴增曲線:〔2〕熒光閾值:〔3〕Ct值:CT值的重現(xiàn)性:5、定量原理:理想的PCR反響:*=*0*2n非理想的PCR反響:*=*0(1+E*)nn:擴增反響的循環(huán)次數(shù)*:第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量*0:初始模板量E*:擴增效率5、標(biāo)準(zhǔn)曲線6、絕對定量1〕確定未知樣品的C(t)值2〕通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的熒光標(biāo)記:二、實時熒光定量PCR的幾種方法介紹方法一:SYBRGreen法〔一〕工作原理1、SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位2、SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光3、變性時,DNA雙鏈分開,無熒光4、復(fù)性和延伸時,形成雙鏈DNA,SYBRGreen發(fā)熒光,在此階段采集熒光信號。PCR反響體系的建立及優(yōu)化:1、SYBRGreen使用濃度:太高抑制Taq酶活性,太低,熒光信號太弱,不易檢測2、Primer:引物的特異性高,否則擴增有雜帶,定量不準(zhǔn)3、MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物4、反響B(tài)uffer體系的優(yōu)化5、反響溫度和時間參數(shù):由酶和引物決定6、其他與常規(guī)PCR一樣〔二〕應(yīng)用圍1、起始模板的測定;2、基因型的分析;3、融解曲線分析:可以優(yōu)化PCR反響的條件,對常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義,如對primer的評價;可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物?!踩硟?yōu)點及缺點優(yōu)點:對DNA模板沒有選擇性;適用于任何DNA;使用方便;不必設(shè)計復(fù)雜探針;非常靈敏;廉價。缺點:容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合,產(chǎn)生假陽性;但可以通過融解曲線的分析,優(yōu)化反響條件;對引物特異性要求較高。方法二:TaqMan---水解型雜交探針**5′端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter,R),如FAM、VIC等**3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)
**探針完整,R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收,無熒光,R與Q分開,發(fā)熒光**Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性,可水解探針〔一〕工作原理注意:每擴增一條DNA分子,釋放一個熒光信號,可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光PCR反響的建立:1、引物、探針的設(shè)計:探針Tm為68-70℃,<30bp,5’不能有G,G可能會淬滅熒光素,引物盡量靠近探針,擴增片段<400bp,引物Tm為59-60℃2、反響參數(shù)確實定:一般為:94℃,10-20S
60℃,30-60S〔Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高〕也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度72℃,45S,3、優(yōu)化引物和探針濃度:獲得最小Ct值,信號/背景比值的最大值引物濃度:50-900nM
探針濃度:50-250nM4、其他與常規(guī)PCR一樣〔二〕優(yōu)缺點優(yōu)點:對目標(biāo)序列的高特異性------陰性結(jié)果確定設(shè)
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