RT-PCR詳細(xì)圖文解析

一、實時熒光定量PCR原理〔一〕定義：在PCR反響體系中參加熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)展定量分析的方法。〔二〕實時原理1、常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴增反響的終點產(chǎn)物進(jìn)展定量和定性分析無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴增反響實時檢測。2、實時定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反響中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)展定量分析3、如何對起始模板定量？通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)展定量分析.4、幾個概念：〔1〕擴增曲線：〔2〕熒光閾值：〔3〕Ct值：CT值的重現(xiàn)性：5、定量原理：理想的PCR反響：*=*0*2n非理想的PCR反響：*=*0(1+E*)nn：擴增反響的循環(huán)次數(shù)*：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量*0：初始模板量E*：擴增效率5、標(biāo)準(zhǔn)曲線6、絕對定量1〕確定未知樣品的C(t)值2〕通過標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的熒光標(biāo)記：二、實時熒光定量PCR的幾種方法介紹方法一：SYBRGreen法〔一〕工作原理1、SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位2、SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光3、變性時，DNA雙鏈分開，無熒光4、復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。PCR反響體系的建立及優(yōu)化:1、SYBRGreen使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號太弱，不易檢測2、Primer：引物的特異性高，否則擴增有雜帶，定量不準(zhǔn)3、MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物4、反響B(tài)uffer體系的優(yōu)化5、反響溫度和時間參數(shù):由酶和引物決定6、其他與常規(guī)PCR一樣〔二〕應(yīng)用圍1、起始模板的測定；2、基因型的分析；3、融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反響的條件，對常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義，如對primer的評價；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物?！踩硟?yōu)點及缺點優(yōu)點：對DNA模板沒有選擇性；適用于任何DNA；使用方便；不必設(shè)計復(fù)雜探針；非常靈敏；廉價。缺點：容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性；但可以通過融解曲線的分析，優(yōu)化反響條件；對引物特異性要求較高。方法二：TaqMan---水解型雜交探針**5′端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter,R)，如FAM、VIC等**3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q)

**探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光**Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針〔一〕工作原理注意：每擴增一條DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光PCR反響的建立：1、引物、探針的設(shè)計：探針Tm為68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能會淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴增片段<400bp，引物Tm為59-60℃2、反響參數(shù)確實定：一般為：94℃，10-20S

60℃，30-60S〔Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高〕也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度72℃，45S，3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，信號/背景比值的最大值引物濃度：50-900nM

探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR一樣〔二〕優(yōu)缺點優(yōu)點：對目標(biāo)序列的高特異性------陰性結(jié)果確定設(shè)