ghrelin對大鼠下丘腦和垂體的調(diào)控

ghrelin對大鼠下丘腦和垂體的調(diào)控

ghrelin是1999年日本科學(xué)家cotomima等從大鼠胃中提取并確定的特定內(nèi)源性配體（ghsr）。28個氨基酸殘基由這些氨基酸殘基組成，第三組絲氨酸殘基中有n-serge，n端第三部分氨基酸含量為n-i。該基團對維持自身的生物活性是必須的,去N-端辛?；?則其失去生物活性。Ghrelin在大鼠等多種動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織器官中均有分布。Ghrelin作為內(nèi)分泌系統(tǒng)新發(fā)現(xiàn)的成員之一,其在生長素分泌和能量平衡調(diào)節(jié)中的地位已被肯定,而生殖活動作為動物機體代謝的特殊活動形式,與體內(nèi)的能量代謝密不可分。近年來,越來越多的研究表明,Ghrelin與動物生殖息息相關(guān)。Fernandez-Fernandez等報道,在成年雌性大鼠發(fā)情周期的任何階段,進(jìn)行腦室內(nèi)注射Ghrelin均能抑制促黃體素(Luteinizinghormone,LH)的分泌,而僅在發(fā)情后期減少促卵泡素(Follicle-stimulatinghormone,FSH)的分泌。除此以外,在卵巢切除的大鼠中,Ghrelin還可減少促性腺激素釋放激素(Gonadotrophin-releasinghormone,GnRH)的分泌。Torsello等通過RT-PCR方法發(fā)現(xiàn)在大鼠的腺垂體中,GhrelinmRNA在出生后維持很高的水平,在初情期時顯著下降,但在下丘腦中,出生時幾乎檢測不到GhrelinmRNA,隨后一直保持較低的水平。現(xiàn)有的研究均表明,Ghrelin在動物下丘腦—垂體水平上對動物生殖內(nèi)分泌功能的調(diào)控發(fā)揮著重要作用。目前,關(guān)于Ghrelin在下丘腦、垂體中的定位雖有報道,但仍不完整,有些分布與表達(dá)仍存在爭議,且多集中在Ghrelin參與攝食和能量代謝調(diào)控核團的研究。國內(nèi)外關(guān)于GhrelinmRNA的研究多在定量方面,如Hou等采用RT-PCR方法研究了GhrelinmRNA在大腦皮層中的表達(dá),缺少從分子水平上對GhrelinmRNA在細(xì)胞學(xué)的定位研究。本試驗以性成熟的大鼠為試驗動物,采用免疫組化和原位雜交相結(jié)合的方法探討Ghrelin及其mRNA在大鼠下丘腦、垂體內(nèi)的分布,為進(jìn)一步闡明Ghrelin參與動物生殖調(diào)控提供科學(xué)的理論依據(jù)。1材料和方法1.1試驗動物成年SD大鼠(180~240g)8只,雌雄各半,購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,室溫(22~25℃)飼養(yǎng),自由攝食與飲水。1.2免疫組化檢測試劑Ghrelin一抗為兔抗鼠Ghrelin多克隆抗體,購自美國Sigma公司。PV-9000兩步法免疫組化檢測試劑盒,DAB顯色試劑盒均購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。地高辛標(biāo)記的Ghrelin寡核苷酸探針,原位雜交檢測試劑盒均購自武漢博士德。組織切片機(YD-158R輪轉(zhuǎn)式切片機),Nikon顯微鏡照相系統(tǒng)。1.3組織病理學(xué)(1)處死大鼠,取下丘腦、垂體組織。(2)組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24h。(3)棄去固定液,流水沖洗固定組織12h,梯度酒精脫水。(4)二甲苯透明、浸蠟、包埋。(5)切片:免疫組化、原位雜交分別采用5、7μm連續(xù)切片,切片粘貼在多聚賴氨酸處理載玻片上。1.4免疫組化檢測(1)在40℃恒溫箱內(nèi)過夜干燥切片,二甲苯脫蠟,梯度酒精處理,水化。(2)熱修復(fù)抗原:將切片浸入0.01mol·L-1枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0),微波爐加熱至沸騰后斷電,間隔5~10min后,反復(fù)1~2次。冷卻后PBS(pH7.2~7.6)洗滌1~2次。(3)用3%(V/V)H2O2室溫孵育10min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶,PBS洗3次。(4)滴加Ghrelin一抗(1∶200),4℃過夜。(5)按照PV-9000兩步法免疫組化檢測試劑盒說明,滴加polymerhelper(GBI,USA),37℃孵育20min,PBS洗3次,每次2min。(6)滴加Polyperoxidase-anti-mouse/rabbitIgG(GBI,USA),37℃孵育30min,PBS洗4次,每次5min。(7)DAB顯色20s,蒸餾水洗滌。(8)蘇木素輕度復(fù)染,脫水,透明,封片。對照組用PBS代替一抗,其余步驟同上。1.5rtcaaagaggg-3使用地高辛標(biāo)記的Ghrelin寡核苷酸探針,其序列如下:(1)5′-CACCAGAAAGCCCAGCAGAGAAAGGAATCCAAGAA-3′;(2)5′-TGGCTCCACCCAGAGGACAGAGGACAAGCAGAAGA-3′;(3)5′-CAGGATATCCTCTGGGAAGAGGTCAAAGAGGCGCC-3′。所有溶液用DEPC水配制。原位雜交程序均按試劑盒(武漢,博士德)說明進(jìn)行。(1)雜交前處理。切片,常規(guī)脫蠟水化。3%(V/V)H2O2去離子水孵育10min,蒸餾水洗3次。胃蛋白酶37℃或室溫消化3~30min,暴露mRNA核酸片段。用1%(M/V)多聚甲醛室溫固定10min,蒸餾水洗滌3次;(2)預(yù)雜交。雜交盒底部加20%(V/V)甘油20mL以保持濕度。每張切片加20μL預(yù)雜交液,40℃恒溫箱中作用3h,吸取多余液體,不洗;(3)雜交。每張切片加20μL雜交液,恒溫箱中40℃雜交過夜(時間可根據(jù)雜交情況調(diào)節(jié));(4)雜交后處理。揭掉蓋玻片,37℃2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC各洗滌15min,加封閉液37℃作用30min,甩去多余液體,不洗,滴加SABC、37℃、20min或室溫30min,原位雜交專用PBS洗3次,每次5min,滴加生物素化過氧化物酶,37℃、20min或室溫30min,PBS洗4次,每次5min。DAB顯色,蘇木素復(fù)染,充分水洗,酒精脫水,二甲苯透明,顯微鏡觀察。1.6形態(tài)分析及濃度測定Ghrelin及其基因染色以細(xì)胞核或細(xì)胞漿呈棕黃色為陽性,每組切片中隨機選取5張,對陽性區(qū)域進(jìn)行拍照,用MoticImagesplus2.0形態(tài)分析軟件對陽性細(xì)胞進(jìn)行分析,測量陽性細(xì)胞的灰度值和數(shù)目?；叶戎涤闷骄鶖?shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,其余的用平均數(shù)表示。2結(jié)果2.1治療滌綸陽性神經(jīng)元的細(xì)胞在正中隆起(圖1A)、弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核、室旁核等部位存在大量Ghrelin陽性神經(jīng)細(xì)胞(圖1B),各部分核團細(xì)胞著色深淺不一,如表一。胞體呈不規(guī)則的圓形、卵圓形、梭形、三角形等,神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)充滿棕色的反應(yīng)顆粒,核位于中央或偏向一側(cè)(圖1A、B);對照組無陽性細(xì)胞(圖1C)。2.2少數(shù)腺細(xì)胞測定神經(jīng)垂體無陽性細(xì)胞分布(圖2A),腺垂體中少數(shù)腺細(xì)胞呈陽性,如表1。胞質(zhì)著色較深,胞核為陰性,且染色不一致。胞體呈圓形、卵圓形等(圖2B)。對照組無陽性細(xì)胞(圖2C)。2.3細(xì)胞內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)GhrelinmRNA主要在下丘腦弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核(圖1~3A)、正中隆起、室旁核等(圖1~3B)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。陰性對照組則沒有表達(dá)(圖1~3C)。2.4色的陽性反應(yīng)顆粒,神經(jīng)部分在大鼠腺垂體的大部分腺細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)充滿棕色的陽性反應(yīng)顆粒,核周也有少量著色(圖4A、B),而神經(jīng)垂體則無(圖4A)。陰性對照組未見陽性反應(yīng)產(chǎn)物(圖4C)。3grtelinmrna在腺垂體細(xì)胞中的表達(dá)本試驗結(jié)果表明,Ghrelin主要分布在大鼠下丘腦的弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核、正中隆起、室旁核等區(qū)域,這與Miller等在綿羊和Judit等在人類下丘腦中的Ghrelin研究結(jié)果一致,這意味這Ghrelin在哺乳動物下丘腦中的分布可能沒有物種差異性。下丘腦的弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核、正中隆起等區(qū)域有神經(jīng)末梢和神經(jīng)肽Y、刺鼠相關(guān)蛋白、阿片促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原等神經(jīng)元相連,且此區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元多與動物的采食、體質(zhì)量、能量平衡以及生殖激素的調(diào)節(jié)有關(guān)。因此,Ghrelin可能在動物的攝食、能量代謝與生殖調(diào)控之間發(fā)揮著橋梁與紐帶作用。另外,形態(tài)學(xué)研究已證實在下丘腦弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核和正中隆起等區(qū)域分布GnRH神經(jīng)元胞體及纖維,是參與調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌功能的重要區(qū)域,尤其是正中隆起處,大約有50%~70%的GnRH神經(jīng)元投射到正中隆起,支配腺垂體LH的分泌。由此可見,Ghrelin在下丘腦這些核團中的分布,為Ghrelin參與調(diào)節(jié)GnRH神經(jīng)元的活動奠定了組織學(xué)基礎(chǔ)。目前,對GhrelinmRNA在動物下丘腦中表達(dá)的研究資料大多是關(guān)于定量方面的,如張文龍等用實時熒光RT-PCR方法檢測了發(fā)情期和間情期大鼠的下丘腦中GhrelinmRNA的表達(dá)豐度。而對于GhrelinmRNA在下丘腦的細(xì)胞學(xué)定位研究較少,特別是具體的分布規(guī)律仍不清楚。我們通過原位雜交試驗對GhrelinmRNA在大鼠下丘腦中的表達(dá)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)在大鼠的整個下丘腦中均有GhrelinmRNA表達(dá),其中在下丘腦弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核和正中隆起、室旁核等處的核團中有大量表達(dá)。這與GhrelinmRNA在人下丘腦中的分布類似,也與Ghrelin在下丘腦中的分布一致。我們通過用圖像分析系統(tǒng)對兩組試驗內(nèi)陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù),并進(jìn)行灰度值分析,也顯示了Ghrelin與GhrelinmRNA分布的一致性。同時,我們的研究結(jié)果進(jìn)一步從分子水平上闡明了Ghrelin和GnRH之間的內(nèi)在聯(lián)系。Ghrelin可能是GnRH分泌的一個新的調(diào)控因子,但對于Ghrelin是直接作用于GnRH神經(jīng)元還是通過其他介質(zhì)介導(dǎo)還有待于進(jìn)一步研究。在大鼠腦垂體中,我們發(fā)現(xiàn)Ghrelin主要分布在腺垂體的少數(shù)腺泡細(xì)胞內(nèi),而神經(jīng)垂體未見其表達(dá)。Miller等發(fā)現(xiàn)Ghrelin主要分布在綿羊腺垂體中。腺垂體是促性腺激素分泌中心,是LH、FSH、LH-FSH3種促性腺激素細(xì)胞在腦垂體中密集分布區(qū)域。Ghrelin免疫陽性細(xì)胞在腺垂體中的大量分布說明了Ghrelin可能參與促性腺激素的分泌。通過原位雜交試驗發(fā)現(xiàn),GhrelinmRNA在腺垂體的大部分腺細(xì)胞中表達(dá),神經(jīng)垂體中無GhrelinmRNA表達(dá),這同Ghrelin在垂體上的分布并不完全一致。陽性細(xì)胞計數(shù),灰度值分析結(jié)果也顯示Ghrelin與GhrelinmRNA之間的差異性。這意味著Ghrelin在腺垂體細(xì)胞中差異性表達(dá)。李連香等報道GnRH的受體主要分布在腺垂體,而GhrelinmRNA也分布在類似區(qū)域,它們之間可能有