新型仿生支架材料骨形態(tài)發(fā)生及對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖、黏附及分化的影響

新型仿生支架材料骨形態(tài)發(fā)生及對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖、黏附及分化的影響

0生物活性玻璃骨組織工程的核心內(nèi)容包括支撐材料的構(gòu)建、種子細胞的篩選、細胞與支撐材料之間的相互作用和機制。其中支架材料的構(gòu)建是目前研究的熱點,新型骨組織工程支架材料不僅僅以組織替代為目的,而且要能夠促進組織再生,具有良好的生物活性特別是骨誘導性,因此如何研制出具有特定結(jié)構(gòu)和骨誘導活性的仿生骨組織工程材料是亟待解決的關(guān)鍵問題之一。目前骨組織工程常用的支架材料主要分為以下幾類:(1)無機材料:包括羥基磷灰石、磷酸三鈣、生物活性玻璃等,這類材料具有良好的生物相容性、骨傳導性和較好的力學性能,但是這類材料在體內(nèi)不能完全降解,質(zhì)脆,易斷裂。(2)有機高分子材料:主要包括聚乳酸、聚乙酸、聚乙酸-聚乳酸共聚物、聚酸酐和聚己內(nèi)酯等,這類材料原料來源豐富、具有良好的可加工性、可塑性及可構(gòu)建高孔隙率三維多孔支架等優(yōu)點,其缺點是機械強度低,降解速率無法與新骨形成速率匹配,降解產(chǎn)物易引起無菌性炎癥。(3)天然衍生材料:包括膠原、藻酸鹽、纖維蛋白支架、煅燒骨、脫鈣骨基質(zhì)等,其優(yōu)點是生物相容性好,具有天然多孔隙結(jié)構(gòu),缺點是一致性及可修飾性較差。上述材料各有優(yōu)缺點,為了充分發(fā)揮各類材料的優(yōu)勢,彌補其不足,目前多采用聯(lián)合材料制備復合支架的方法。本實驗依據(jù)仿生原理,制備殼聚糖/納米羥基磷灰石/膠原復合材料,此材料是一種具有良好骨傳導性的骨組織工程支架材料,為了進一步改善其骨誘導性,本實驗根據(jù)骨形態(tài)發(fā)生蛋白7的序列特征、晶體結(jié)構(gòu)和其與受體結(jié)合機制,設(shè)計合成含13個氨基酸的新型骨形態(tài)發(fā)生蛋白7多肽(peptidefrombonemorphogeneticprotein7,pBMP-7),將其與殼聚糖/納米羥基磷灰石/膠原材料復合,構(gòu)建新型仿生支架材料pBMP-7/殼聚糖/納米羥基磷灰石/膠原,并探索其對骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)增殖、黏附及分化的影響。1bmscs的分離和培養(yǎng)設(shè)計:單一樣本觀察實驗。時間及地點:于2010-08/11在中南大學衛(wèi)生部肝膽腸外科中心實驗室完成。材料:無菌條件下將pBMP-7用無菌去離子水溶解,使其質(zhì)量濃度為2g/L,然后將殼聚糖/納米羥基磷灰石/膠原復合材料制成5mm×5mm×2mm立方形,將每個材料浸泡于0.5mL多肽溶液中30min,在負壓下抽吸30min,待pBMP-7溶液完全進入材料后,將其置于-20℃預冷1h后凍干,環(huán)氧乙烷消毒,-20℃保存。pBMP-7的體外釋放規(guī)律:取5份復合支架材料,每份負載pBMP-72mg,分別浸入2mLPBS中,充分混勻,置入37℃恒溫箱中,在不同時間點提取釋放液,采用高效液相色譜儀檢測其中pBMP-7的含量,并計算累積釋放量,高效液相色譜儀檢測條件為流動相∶乙腈水為40∶60,固定相為CrestPakC18S柱子(4.6mm×150mm),調(diào)節(jié)流速為1.0mL/min,檢測波長220nm。BMSCs分離培養(yǎng)及鑒定:參照Kadiyala等的方法進行BMSCs的分離培養(yǎng),將SD大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,體積分數(shù)75%乙醇浸泡消毒20min,無菌條件下取出雙側(cè)脛骨和股骨,剪除骨端,用含體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基沖洗骨髓腔,將沖洗液收集,用滴管緩慢滴加于Ficoll分離液上層,離心收集云霧狀細胞層,PBS懸浮洗滌3次后,用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基吹打成均勻懸液后,以3×107L-1細胞數(shù)接種至50mL培養(yǎng)瓶,置于37℃、體積分數(shù)5%CO2及飽和濕度孵育箱中,3d后首次換液,以后每兩三天換液,當細胞生長融合達70%~80%時,用0.25%的胰酶消化,以1∶3的比例傳代培養(yǎng)。并進行CD90和CD34、表面標志物檢測。BMSCs與pBMP-7/殼聚糖/納米羥基磷灰石/膠原復合材料的復合培養(yǎng):取生長良好的第3代BMSCs,調(diào)整細胞濃度為1×108L-1,接種到置于24孔板的pBMP-7/殼聚糖/納米羥基磷灰石/膠原材料上,每孔1mL。常規(guī)培養(yǎng)72h后將材料取出,PBS緩沖液漂洗3次后將材料用2.5%的戊二醛固定,體積分數(shù)30%~100%的梯度乙醇脫水,真空干燥,表面噴金處理后在掃描電鏡下進行觀察。BMSCs黏附率的檢測:在24孔培養(yǎng)板內(nèi)置入復合pBMP-7的支架材料12片作為實驗組,以12片未復合多肽的支架材料作為對照組。將細胞濃度為5×108L-1的細胞懸液0.1mL滴加到兩組材料上。置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),于4,12h后在實驗組和對照組中各取出6片材料,PBS緩沖液沖洗3次,去除未黏附細胞。用0.25%的胰蛋白酶進行消化收集細胞并計數(shù),計算細胞黏附率。細胞黏附率=黏附細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。BMSCs增殖檢測:取生長良好的第3代BMSCs,調(diào)整細胞濃度為1×108L-1,接種到置于24孔板的復合pBMP-7的支架材料上作為實驗組,每孔1mL,以未復合多肽的支架材料作為對照。接種后2,4,6,8,10d對實驗組和對照組細胞進行MTT檢測,每組5個復孔。每孔加入MTT(5g/L)0.1mL,37℃繼續(xù)孵育4h。棄上清液,每孔加入二甲基亞砜1mL,振蕩10min,紫外分光光度計上(選擇波長為570nm)讀取吸光度值,記錄結(jié)果,繪制生長曲線。BMSCs分化檢測:取18片復合pBMP-7的支架材料作為實驗組,未復合pBMP-7的材料作為對照組,分別置于24孔培養(yǎng)板中。取第3代BMSCs,調(diào)整細胞濃度為5×108L-1,接種在支架材料表面,分別在復合培養(yǎng)第7,14,21天各取出6片材料,PBS沖洗3次,用胰酶消化并收集細胞,加細胞裂解液破膜,按試劑盒說明檢測各組細胞堿性磷酸酶活性。主要觀察指標:支架材料表面細胞增殖、黏附率、生長形態(tài)及堿性磷酸酶活性。統(tǒng)計學分析:采用SPSS11.5統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理,所得數(shù)據(jù)采用表示,兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗,P<0.05為差異有顯著性意義。2結(jié)果2.1pb-7外殼聚糖納米烷基磷灰石納米烷基材料的微觀形狀電鏡觀察結(jié)果見圖1所示,可見該復合材料是一種疏松多孔結(jié)構(gòu),孔徑為10~100μm不等。2.2爆發(fā)性釋放情況第1天時pBMP-7釋放量占總量的(32.5±1.22)%,呈爆發(fā)性釋放,以后呈緩慢持續(xù)釋放,至14d累積釋放量占總量的(64.02±4.21)%。2.3細胞生長情況觀察BMSCs分別與pBMP-7/殼聚糖/納米羥基磷灰石/膠原復合材料和未復合多肽的殼聚糖/納米羥基磷灰石/膠原復合材料培養(yǎng)7d后,用掃描電鏡觀察細胞生長情況,結(jié)果見圖3,4?？梢娫趶秃隙嚯牡牟牧媳砻嬗写罅考毎仕笮?有大量突起,并相互連接成片,在未復合多肽的材料表面只有少量細胞,且細胞突起很少,這表明BMSCs在復合了多肽的材料表面生長良好。2.4圖5顯示了bmsc在支撐材料表面的生長情況在復合培養(yǎng)期間,兩組材料對BMSCs的增殖無明顯影響(P>0.05)。2.5兩組患者的分布培養(yǎng)4h時實驗組黏附率為(33.32±4.32)%,對照組黏附率為(10.05±2.19)%,兩組間差異有非常顯著性意義(P<0.01);12h時實驗組黏附率為(61.26±5.47)%,對照組黏附率為(31.54±3.01)%,兩組間差異有非常顯著性意義(P<0.01)。2.6表1顯示了bmsc材料表面的差異由表1可見。各個時間點實驗組堿性磷酸酶活性明顯高于對照組(P<0.01),表明實驗組材料具有誘導成骨能力。3復合pbmp-7支架材料對bmscs釋放的影響目前骨組織工程常用的支架材料主要分為:無機材料、有機高分子材料及天然衍生材料等。上述各類材料各有優(yōu)缺點,為了充分發(fā)揮各類材料的優(yōu)勢,彌補其不足,目前多采用聯(lián)合材料制備復合支架的方法,本實驗就是根據(jù)這一思路,將殼聚糖、羥基磷灰石及膠原復合,充分發(fā)揮3種材料的優(yōu)勢,制備出殼聚糖/納米羥基磷灰石/膠原復合材料,此材料是一種新型仿生無機相/有機相復合骨組織工程支架材料,其中納米羥基磷灰石晶體在形態(tài)、尺寸、組成、結(jié)構(gòu)和結(jié)晶度上與人骨的羥基磷灰石晶體高度類似;材料中含有的殼聚糖和膠原,生物相容性好,且有利于生成類骨質(zhì)進而礦化,掃描電鏡結(jié)果表明該復合材料是一種疏松多孔結(jié)構(gòu),孔徑為10~100μm不等,與天然骨組織疏松多孔結(jié)構(gòu)相似。天然骨組織中含有骨誘導活性物質(zhì),能夠誘導骨組織生長,因此為了賦予殼聚糖/納米羥基磷灰石/膠原復合材料骨誘導性,進一步達到仿生的目的,本實驗設(shè)計合成含13個氨基酸的pBMP-7,將其與殼聚糖/納米羥基磷灰石/膠原材料復合,構(gòu)建新型仿生支架材料pBMP-7/殼聚糖/納米羥基磷灰石/膠原。pBMP-7是一種新型的多肽活性分子,具有與骨形態(tài)發(fā)生蛋白7類似的生物活性,同時還具有分子量小,空間結(jié)構(gòu)簡單呈螺旋狀,活性位點易于暴露,易于與支架材料復合,易于大規(guī)模制備,成本低廉等優(yōu)點。一般認為支架材料復合生物活性因子后,只有生物活性因子從材料中緩慢釋放,才能最大限度的發(fā)揮其生物學作用。本實驗檢測了pBMP-7在材料中的釋放規(guī)律,結(jié)果表明,pBMP-7在第1天時呈爆發(fā)釋放,之后呈緩慢持續(xù)釋放,基本達到了緩釋的要求,其中前期的爆發(fā)釋放是真空吸附方式復合生物活性因子的共有特點,主要是由于附著在支架材料表面的活性因子,在溶液中迅速溶解擴散而引起的,后期的緩慢釋放機制可能為:pBMP-7的等電點偏酸性,可以與材料中的納米羥基磷灰石晶體結(jié)合,隨著材料的降解而緩慢釋出。骨組織工程支架材料作為人工細胞外基質(zhì),要為細胞的黏附、生長、分化,以及進行新陳代謝,形成新組織提供支持,因此要具備良好的細胞相容性。本實驗將pBMP-7/殼聚糖/納米羥基磷灰石/膠原與BMSCs復合培養(yǎng),觀察其對BMSCs增殖、黏附及分化的影響,從而評價其細胞相容性。細胞與材料的黏附細胞遷移、增殖和分化的基礎(chǔ),材料表面的親疏水性、表面荷電特性及活性基團等都對材料的黏附性有較大的影響。在實驗中作者發(fā)現(xiàn)復合pBMP-7的支架材料與單純支架材料相比可以顯著促進BMSCs的黏附,這是因為復合pBMP-7支架材料表面帶正電荷,有利于細胞膜帶負電荷的BMSCs黏附,同時行掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn),細胞在復合pBMP-7的支架材料表面鋪展良好,呈梭形或多角形,這表明pBMP-7能夠明顯改善支架材料的黏附性。在細胞增殖實驗中,作者發(fā)現(xiàn)細胞在兩組材料表面的生長曲線相似,無差異,這說明復合pBMP-7的支架材料與單純支架材料相比對BMSCs的生長增殖無影響。在細胞分化實驗中,作者發(fā)現(xiàn)將BMSCs與兩組材料復合培養(yǎng)7,14,21d后,復合了pBMP-7的支架材料表面細胞的堿性磷酸酶活性明顯高于單純支架材料組。堿性磷酸酶是具有成骨潛能的細胞標志性酶之一,可間接反映細胞的成骨活性,因此本實驗結(jié)果表明復合了pBMP-7的支架材料具有良好的骨誘導性,能夠促進其表面的BMSCs分化為成骨細胞。綜上所述,pBMP-7/殼聚糖/納米羥基磷灰石/膠原復合材料作為一種新型仿生復合骨組織工程支架材料具有良好的細胞相容性,能夠促進細胞在其表面增殖、黏附及分化,是一種很有前景的骨組織工程支架材料。實驗動物:30~35d齡健康SpragueDawley(SD)大鼠8只,清潔級,雌雄不限,平均體質(zhì)量110(100~120)g,由湘雅醫(yī)學院動物中心提供,動物許可證號:SCXK(湘)2006-0002。實驗方法:pBMP-7/殼聚糖/納米羥基磷灰石/膠原復合材料的制備:取10g膠原,溶于200mL、0.5mol/L的醋酸溶液中,均勻攪拌,使其充分溶解,在上述膠原溶液中緩