雙耳緣靜脈留置針誘導的靜脈炎模型的建立

雙耳緣靜脈留置針誘導的靜脈炎模型的建立

靜脈炎是指長期服用濃度高、刺激性強的藥物，或靜脈內長期放置刺激性強的塑料導管，導致局部靜脈壁出現(xiàn)化學炎癥反應。發(fā)病率為30%70%。這是臨床上靜脈輸液最常見的并發(fā)癥。不少學者對輸液性靜脈炎的防治機制進行了研究,但對靜脈炎的形成機制報道尚少。本研究以連續(xù)5d20%甘露醇靜脈注射造成的靜脈炎為基礎,建立靜脈損傷(Ⅲ級靜脈炎)動物模型,旨在探討靜脈損傷及形成機制,為進一步研究防治方法及機制提供參考。1材料和方法1.1材料表面1.2方法2結果3理公中的理法表達變化ICAM-1是黏附分子免疫球蛋白超家族中的一個成員,主要功能是介導細胞與細胞間以及細胞與細胞外基質間的黏附。炎性因子TNF-α的釋放可以促進血管內皮細胞和炎性細胞間相關黏附因子ICAM-1的高表達。本研究表1顯示,正常兔耳組織中ICAM-1有少量表達,模型組比正常對照組ICAM-1表達量顯著增加。Takeuchi等研究也發(fā)現(xiàn),ICAM-1這類分子可以使炎癥反應從受創(chuàng)部位皮膚向未受創(chuàng)部位皮膚蔓延,從而促進炎癥反應的擴散。綜上所述,本研究通過靜脈炎動物模型的建立,初步認為靜脈炎發(fā)生的機制可能與炎性因子TNF-α、ICAM-1表達水平上調有關。但是,靜脈炎的形成是一個復雜的病理、生理過程,除TNF-α、ICAM-1指標外,今后尚需進一步探索和研究其他因素與靜脈炎發(fā)生之間的關系,為靜脈炎防治提供更多的理論依據(jù)。1.1.1syxk浙選用健康新西蘭大耳兔,由浙江省金華市藥品檢驗所提供,許可證號:SYXK(浙)2010-0151,體質量2.0~2.5kg,雌雄不限,兔耳無瘢痕、畸形或損傷。新購買動物先在動物實驗中心適應性喂養(yǎng)1周,單籠飼養(yǎng),飲食活動均正常,無其他系統(tǒng)疾病。1.1.2藥物、試劑和儀器20%甘露醇(華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司)、生理鹽水(安徽雙鶴藥業(yè)責任有限公司)、肝素鈉注射液(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)、一次性靜脈留置針(美國BD公司)、3M透明敷貼(美國3M公司)、苯巴比妥鈉(上海新亞藥業(yè)有限公司)、TNF-α、ICAM-1多克隆抗體、試劑盒(武漢博士德有限公司)。1.2.1制作靜脈留置針按標準選取10只健康新西蘭同種家兔,隨機分為正常對照組和模型組。模型組5只參照路顏羽方法進行建模,隨機編號,單籠飼養(yǎng),選用美國BD公司生產的Vialon材料24G靜脈留置針在兔雙耳緣靜脈穿刺置管,由專人統(tǒng)一操作,穿刺成功后,注射甘露醇10mL,15min注完,每日注射1次。注射完畢以25U/mL肝素鈉溶液正壓封管,妥善固定后保留。再次注射藥物時,常規(guī)消毒肝素帽,將4.5號靜脈注射用頭皮針刺入肝素帽內,留置5d形成條索狀靜脈(Ⅲ級靜脈炎)后拔除留置針。正常對照組5只,不進行靜脈留置針穿刺,但同樣進行雙耳包扎,共5d。1.2.2靜脈炎的分級和分型按照美國靜脈輸液護士協(xié)會(INS)制定的標準,結合動物實驗特點,去除評價標準中有關疼痛的指標,將靜脈炎分為5個等級:0級,無癥狀;Ⅰ級,局部紅腫或水腫,靜脈無條索狀改變,未觸及硬結;Ⅱ級,局部紅腫或水腫,靜脈有條索狀改變,未觸及硬結;Ⅲ級,局部紅腫或水腫,靜脈有條索狀改變,可觸及硬結;Ⅳ級,局部紅腫或水腫,靜脈有條索狀改變,可觸及硬結。本研究以滿足Ⅲ級靜脈炎標準為造模成功。1.2.3模型2:比例大,長度低模型組3只建模成功,拔除留置針后,正常對照組5只和模型組3只實驗兔均采用苯巴比妥鈉腹腔麻醉后取材。正常對照組:取耳緣靜脈中段兩側各寬0.5cm、長約3.0cm的矩形標本,從矩形兩端分別截取兩段0.5cm標本。模型組:以穿刺血管為中線兩側各寬0.5cm,以穿刺點為標記,選取遠心端0.5cm、近心端2.5cm共長約3.0cm的矩形標本,截取穿刺點至近心端0.5cm處、留置針套管末端至遠心端0.5cm處的兩段標本。取材后立即放入10%中性甲醛固定液中固定,送病理科。24h后常規(guī)乙醇脫水,石蠟包埋,每個標本連續(xù)切片,厚度2~5μm,并分別檢測腫瘤壞死因子(TNF-α)、細胞間黏附分子(ICAM-1)表達情況及常規(guī)蘇木精-伊紅染色光鏡下觀察病理變化。1.2.4觀察指標1.2.4.血管周圍期濾菌ue0d借助光鏡觀察血管壁完整性、炎性細胞浸潤程度,具體參照趙曉燕等、崔愛榮等、Grüne等對炎癥反應的判斷標準,分為4個等級:無炎癥反應(-),僅見血管周圍結締組織充血水腫;輕度炎癥(+),血管周圍結締組織見淋巴細胞、漿細胞浸潤,血管壁及血管腔未見炎性細胞;中度炎癥(ue0d1),血管周圍結締組織及血管壁各層有淋巴細胞、漿細胞及少許中性粒細胞浸潤;重度炎癥(ue0d2),血管周圍結締組織、血管壁各層及血管腔可見彌漫性淋巴細胞、中性粒細胞浸潤,血管腔內可見較多的滲出物及壞死的細胞碎片。1.2.4.tnf-,icam-1檢測采用免疫組織化學S-P法檢測,操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行(TNF-α一抗、ICAM-1一抗均1∶100稀釋),染色玻片于顯微鏡下觀察和照相,TNF-α、ICAM-1均以細胞核染成棕黃色作為陽性判定標準。每張切片選取5個高倍視野(×200),每個視野總細胞數(shù)不少于500個,計數(shù)視野中包括炎性細胞、血管內皮細胞的陽性細胞總數(shù),計算每個視野中的平均陽性細胞數(shù),再計算每組平均每個高倍視野中的陽性細胞數(shù)。1.2.5閱讀邀請2名經驗豐富的病理科醫(yī)生獨立對切片進行評價,該病理科醫(yī)生事先不知道切片的分組情況,充分避免偏倚的發(fā)生。1.2.6統(tǒng)計方法采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料采用ue0af±s表示,組間比較采用獨立樣本t檢驗,檢驗水準α=0.05。2.1彈性好，好于彈性正常對照組10條兔耳緣靜脈清晰,血管軟,彈性好。模型組6條靜脈滿足Ⅲ級靜脈炎造模標準,兔耳局部皮膚發(fā)紅、腫脹,血管變硬,彈性下降,沿血管走向出現(xiàn)條索樣改變。2.2炎性細胞浸漬,無炎癥反應正常對照組血管內皮連續(xù)光滑,血管內皮細胞結構正常,血管壁完整,周圍無炎性細胞浸潤,無炎癥反應(-)(見圖1a)。模型組表現(xiàn)為血管壁結構模糊,內皮細胞斷裂、脫失,成纖維細胞增生,血管腔內大量炎性滲出物,有血栓形成,血管周圍炎性細胞浸潤,為中度炎癥或者重度炎癥(見圖1b)。2.3局部靜脈tnf和icam-1的出現(xiàn)2.3.1tnf-蛋白表達TNF-α陽性細胞主要為血管內皮細胞、中性粒細胞、漿細胞及淋巴細胞等,免疫組化著色部位為細胞核,DAB顯色呈棕黃色。正常對照組TNF-α蛋白低表達(見圖2a),模型組TNF-α蛋白表達增加(見圖2b)。兩組陽性細胞計數(shù)比較見表1(每只兔子留取4塊標本,最終取標本時對照組5只兔子,即20條靜脈;模型組因2只造模失敗,棄去,留取標本為3只兔子即12條靜脈)。2.3.2小鼠骨髓正常組性免疫指標dab蛋白表達ICAM-1陽性細胞主要為血管內皮細胞、淋巴細胞等,免疫組化著色部位為細胞核,DAB顯色呈棕黃色。正常對照組ICAM-1蛋白低表達(圖3a),模型組ICAM-1蛋白表達明顯增加(圖3b)。兩組陽性細胞計數(shù)比較見表1。3.1%甘露醇是血管內皮功能的樞紐本研究模擬臨床輸液,先進行靜脈留置再輸入甘露醇溶液,連續(xù)5d即可出現(xiàn)條索狀靜脈,肉眼觀察和蘇木精-伊紅染色顯示中到重度的炎癥反應,而對照組無病變,說明藥物和穿刺針刺激可共同導致靜脈炎。首先,這可能與靜脈留置針對血管的機械刺激直接損傷血管內皮細胞有關。Subha等報道留置針阻塞血管加上局部包扎和制動,使血流變慢,內皮細胞的超微結構發(fā)生變化,甚至整個細胞失去正常結構,從而增加膠原纖維的暴露。留置針在血管內可改變血流方向,同時注藥時對血液產生沖擊,形成渦流與湍流,直接損傷內皮細胞與紅細胞,后者釋放二磷酸腺苷(ADP)可介導血小板活化,導致局部血栓形成。其次,20%甘露醇是一種高滲溶液,以微粒形式存在于溶液中,大量微粒在短時間進入靜脈引起血栓,造成局部堵塞和供血不足,組織缺氧而產生水腫和炎癥。同時,輸入甘露醇時血漿滲透壓升高,致使組織液滲透壓隨之升高,血管內皮細胞脫水,進而局部血小板聚集,并釋放前列腺素E1、前列腺素E2,靜脈壁通透性增強,白細胞浸潤并產生炎癥改變,同時釋放組胺,使靜脈收縮、變硬。Malek等研究發(fā)現(xiàn),甘露醇對血管內皮細胞也可產生直接有害的影響,激活炎性介質和絲分裂素-活化蛋白激酶,直接引發(fā)血管內皮細胞凋亡。由此可見,本研究是由靜脈留置針機械刺激和藥物刺激雙重作用導致的靜脈炎,其靜脈血管損傷的關鍵原因是血管內皮細胞的損傷,引起的重要變化是炎癥反應和血栓形成。3.2家兔耳組織tnf-表達變化TNF-α主要是由單核巨噬細胞所分泌的一種細胞因子,在各種生理病理情況下如細菌感染、腫瘤可大量產生,是一種功能強大的炎性介質。本研究表1