生物溶菌酶的研究與應(yīng)用

生物溶菌酶的研究與應(yīng)用

生物溶菌酶是一種能夠溶解微生物酶的酶，通常是堿性或中性蛋白質(zhì)。它廣泛存在于高等動物組織及分泌物(如唾液、淚液、血清、淋巴等)、原生動物、昆蟲以及植物和各種微生物中。早在上世紀初Nicolle曾報道枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生一種溶菌因子,不久有人指出,雞卵白的強烈凈菌能力是由于酶的作用。1922年,青霉素的發(fā)明人Fleming從人的多種組織及微生物中,證實了這種溶菌因子的存在,并命名為溶菌酶(Lysozyme)。1945年Alderton等分離出了雞卵白溶菌酶(eggwhitelysozyme)的結(jié)晶,它是目前結(jié)構(gòu)與功能被了解最清楚的酶種之一。“溶菌酶”作為雞卵白溶菌酶(eggwhitelysozyme)的一個約定俗成的名稱,在國內(nèi)依然被廣泛采用。本文中的生物溶菌酶特指通過溶解細胞壁,導(dǎo)致微生物死亡的溶菌酶。生物溶菌酶的殺菌作用具有底物專一性:一種酶只專一的作用于一種特定底物。一般情況能殺滅革蘭氏陽性菌者對革蘭氏陰性菌的殺滅效果較弱,反之亦然。此外酶的殺菌作用通常是幾種酶共同作用的結(jié)果,復(fù)合酶的殺菌效果比單一酶好。生物溶菌酶在口腔消毒及治療中的應(yīng)用研究開始于80年代,目前比較成熟的有溶菌酶(Lysozyme),溶葡萄球菌酶(Lysostaphin)等。1.一般生物溶菌酶的介紹1.1改變細菌表面結(jié)構(gòu)是一類能使細菌或酰胺酵母菌與霉菌細胞壁溶解,導(dǎo)致微生物死亡的溶菌因子。各酶群可單獨或與化學(xué)制劑協(xié)同殺滅微生物。由于溶菌酶溶菌作用機制復(fù)雜,通常是由幾種酶或非酶物質(zhì)的協(xié)同作用,使細菌細胞壁發(fā)生溶解,而不是單一酶作用。革蘭氏陽性細菌細胞壁主要由肽聚糖(Peptidoglycan)等多糖和小分子肽蛋白組成,在細胞壁的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中糖苷鍵和肽鍵是其主要的連接鍵。溶菌酶可通過水解細胞壁和外膜層中肽聚糖的糖苷鍵(N—乙酰胞壁酸C-1與N—乙酰葡萄糖胺C-4之間的β-1,4糖苷鍵、肽鍵如D-Ala與Lys間肽鍵等)和酰胺鍵(如N-乙酰壁酸與Ala間酰胺鍵等),使細菌細胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞,細胞壁溶解而死亡。運用化學(xué)修飾的方法,如將雞卵白溶菌酶中的賴氨酸與棕櫚酸共價結(jié)合,改變其結(jié)構(gòu),增強對細菌外殼蛋白的溶解作用,可使原本只能溶解革蘭氏陽性菌的雞卵白溶菌酶也可殺滅大腸桿菌等革蘭氏陰性菌。此外,利用DNA重組技術(shù),將產(chǎn)酶微生物核酸中產(chǎn)酶基因內(nèi)疏水五肽部份融合到C末端,可使溶菌酶具有殺滅大腸桿菌的作用。1.2溶球形酶的功能溶葡萄球菌酶(Lysostaphin)是一種含Zn的金屬蛋白酶。Gaier等人利用生物工程技術(shù)成功地在枯草桿菌和乳酸桿菌中克隆并表達了溶葡萄球菌酶。Brarnlcy和馬力等將金黃色葡萄球菌(S.simulans株)中的部分基因克隆入枯草桿菌,不僅表達了溶葡萄球菌酶,并使產(chǎn)酶量增加,殺菌作用增加。目前,重組溶葡萄球菌酶是國際上研究較成熟的生物工程類生物酶,其分子量為25000dt,由246個氨基酸組成。當處于酶原狀態(tài)時,N-端有143個氨基酸前導(dǎo)序列,分子量為42000dt。酶作用的最適pH為10-11,在pH5-8時4℃可穩(wěn)定24h。基因的核酸組成有1486個核苷酸。溶葡萄球菌酶能專一降解細胞壁肽聚糖中的甘氨酸肽鍵,從而對金黃色葡萄球菌等致病菌起到殺滅作用。1998年Climo-MW等介紹了溶葡萄球菌酶對耐萬古霉素的葡萄球菌有很好的殺菌效果。由于它是一種含Zn的蛋白酶,所以還有修復(fù)破損黏膜的作用。1995年,郇京寧等在應(yīng)用中發(fā)現(xiàn),該酶具有增強人體巨噬細胞吞噬能力的作用。有文獻報道,溶葡萄球菌酶和溶菌酶在特定比例配伍后,對革蘭氏陽性菌的殺菌效果大大增強。2.生物溶液對口腔消毒和治療的應(yīng)用生物溶菌酶制劑目前已應(yīng)用于口腔病預(yù)防和治療;它的功能特性主要表現(xiàn)在殺菌,增強機體免疫力,修復(fù)組織這三個方面。2.1種一種重要的致病性微生物腫瘤化療病人常易發(fā)生口腔黏膜的脫落和炎癥,并伴有潰瘍,易感染霉菌。使用生物溶菌酶清潔口腔,不但能有效預(yù)防感染,同時還能減輕口腔黏膜干燥等化療反應(yīng)癥狀。變形鏈球菌(Streptococcusmutans,S,mutans)被認為與齲病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),是主要致齲菌。變形鏈球菌的表面有多種細胞表面多聚物,例如壁相關(guān)蛋白、血清特異性抗原、壁磷脂酸以及肽聚糖等。由灰色鏈霉菌和球泡鏈霉菌生產(chǎn)的溶菌酶,可溶解齲齒病原菌變異鏈球菌。據(jù)報道,地鼠感染變異鏈球菌后,再用該溶菌酶處理,有預(yù)防齲齒的效果。溶葡萄球菌酶與增效劑、穩(wěn)定劑還可制成口腔清潔液,對幾種引起口腔疾病的致病菌如葡萄球菌、溶血性鏈球菌、白色念珠菌、厭氧菌等細菌的殺滅效果進行檢測,5min內(nèi)殺菌率達99.9%。急性毒性試驗、蓄積毒性試驗、微核試驗、黏膜刺激試驗等,各項安全性能符合要求。該清潔液可用于健康人群包括孕婦和兒童的口腔疾病預(yù)防。此外,通過使用生物溶菌酶制劑來阻斷口腔傳播途徑,對預(yù)防院內(nèi)肺炎感染和幽門螺旋桿菌感染等都有積極的作用。2.2生物溶菌酶復(fù)方制劑體外殺菌試驗證明,生物溶菌酶復(fù)合制劑能有效抑制和殺滅口咽部致病菌。2001年,長征醫(yī)院對45例急慢性咽炎,扁桃體炎病人用溶葡萄球菌酶復(fù)方制劑治療發(fā)現(xiàn),有效率達到90.0%,在治療7天后咽部細菌培養(yǎng)陰性。智齒冠周炎是細菌繁殖導(dǎo)致智齒周圍牙冠組織感染而引起的口腔疾病。雖然抗生素常規(guī)全身應(yīng)用并輔以局部用藥治療效果確切,但存在全身用藥不良反應(yīng),局部用藥異味等缺點;上海市口腔病防治院的病例對照研究顯示,使用溶葡萄球菌酶復(fù)方制劑治療冠周炎的有效率為83.3%(P<0.001),提示生物溶菌酶局部用藥,可以達到消滅病源菌,治療輕中度口腔細菌感染性疾病。口腔黏膜病中的復(fù)發(fā)性口瘡具有復(fù)發(fā)性和自限性,一般認為發(fā)病原因與人體免疫功能異常有關(guān);此外,在復(fù)發(fā)性口瘡單因素分析中,Zn表現(xiàn)為保護因素;在多因素分析中,Zn表現(xiàn)為強保護因素,這表明缺Zn是復(fù)發(fā)性口瘡最重要的發(fā)病因素之一。生物溶菌酶作為機體非特異性免疫因子之一,參與機體的免疫反應(yīng),從而保持機體生理平衡。它還可改善和增強巨噬細胞吞噬和消化功能,激活白細胞吞噬功能,從而增強機體的免疫力。溶菌酶還具有激活