寒熱證動物模型研究進展

寒熱證動物模型研究進展

本文在過去15年中對軟寒熱綜合征的一般模型進行了如下研究。1冷杉動物模型1.1寒凝瘀證的制備黎敬波等選用Wistar大鼠進行胃潰瘍實寒證造模。給大鼠微量注射20%醋酸造成大鼠胃潰瘍,再灌飼冰水施加寒性刺激,第7d開始檢測指標,成功制成胃實寒證模型。陳艷芳等采用冰NaOH或冰水+NaOH造成胃寒Ⅰ°和Ⅱ°模型,多次試驗結果證實造模大鼠的一般狀況、胃黏膜的病理組織形態(tài)、微觀指標變化等都符合中醫(yī)臨床寒證的表現(xiàn),并以溫性藥為主的反左金丸反證了寒證模型的成功?！秲?nèi)經(jīng)》云:“……寒獨留,則血凝泣,凝則脈不通?！焙畡t凝,凝則成瘀,故寒邪易致寒凝血瘀。鄭小偉[3、4]以中醫(yī)理論為指導,運用現(xiàn)代科學技術手段,在正常大鼠測定呼吸頻率后,將其置于罩有鐵網(wǎng)的瓷盤上,放入-15℃冰箱中持續(xù)受凍4h左右,當動物處于興奮減弱期時復制出寒邪傷陽所致的陽虛寒凝血瘀證。吳墾莉等對家兔后肢局部冷凍,引起紫紺、水腫等癥狀,造成家兔寒凝血瘀證動物模型,以造模后第3~5天各項病理形態(tài)學變化最為明顯。王學江等用同樣的方法建立了小鼠寒凝血瘀證模型。倪瑾[7~8]等將冷凍組家兔的雙側后肢上、下、左、右圍置低溫冰袋(-25℃~-20℃),冷凍1.5h,1d~5d后復制出寒凝血瘀模型。成秀梅等人則將大鼠置于0℃~1℃冰水中20min,每日1次,連續(xù)2周,造成寒凝血瘀證大鼠模型,并經(jīng)溫經(jīng)湯進行方藥反證,大鼠寒性癥狀明顯改善。寒凝血瘀證模型多以受試動物的血液流變學、微循環(huán)、血凝、血栓素、血流量等指標作為模型評價依據(jù)。楊士友等根據(jù)中醫(yī)“風為百病之長”的理論,將SD大鼠置于模擬風(5~6級)、寒(3℃~7℃)環(huán)境中,前期(6d)表現(xiàn)符合中醫(yī)風寒表證的癥狀;后期(14d)表現(xiàn)符合中醫(yī)的寒凝血瘀證,見血液增黏、增稠、增聚,微循環(huán)流態(tài)惡化,微血管管徑、流速、流量降低。此外,還有在腎上腺素+寒冷刺激的復合因素作用下造寒凝血瘀證模型。滕久祥等[11、12]采用皮下注射0.1%鹽酸腎上腺素2次,并在給藥之間于5℃~8℃水中浸泡5min的方法造成大鼠寒凝血瘀模型。蔡錚等運用靜脈注射大量腎上腺素加冰水浴造成寒凝血瘀證家兔模型。1.2制備200%的水餅由于味苦性寒涼中藥易傷陽氣,陽虛則內(nèi)寒,長期大量灌胃寒涼藥的大鼠可呈現(xiàn)出寒證的某些特征,以脾陽虛為主。陳小野用山梔子、黃芩、龍膽草、蓮子心、知母(1∶1∶1∶1∶1)制成水煎劑,1.5g/只,1次給藥,30min出現(xiàn)虛寒癥狀,制成寒證模型。此外,他也用利血平肌注,用藥量10ug/只/d,7至8d可造成虛寒證動物模型。該模型從第5天起出現(xiàn)較穩(wěn)定的中醫(yī)臨床寒證特點。周小軍等選用清潔級豚鼠,用知母、黃柏、生石膏、龍膽(1.5∶1∶1∶1.5)制成180%水煎劑灌胃,每天10g/kg,1次給藥,用藥4周制成豚鼠寒證模型。李良等在梁月華早期建立的動物模型基礎上進一步改進造模方法,直接用知母、石膏(1∶1)制成1kg/L的水溶液,灌胃Wistar雄性大鼠,每天1次,4ml/只,3周后制成虛寒證模型。宋輝等用知母、石膏(3∶4)制成100%的水煎劑,4ml/d,1次灌胃Wistar雄性大鼠造模,3周后制成虛寒證模型,停止喂藥后虛寒狀態(tài)持續(xù)7d以上,并認為是研究藥物治療的良好模型。陳小野等對上述虛寒證的造模方法進行了總結,認為以上虛寒證模型雖基本得到了公認,但存在兩個環(huán)節(jié)的不足:一是可能未能在寒證的基礎上達到寒邪傷陽而致模;二是虛證尚未達到“精氣奪則虛”的程度。于是加大造模劑量,延長造模時間,選擇雌性WistarII級大鼠按體質分組,用知母、生石膏、黃柏、龍膽草(1.5∶2.0∶1.0∶1.2)常規(guī)制成200%煎劑,灌胃28d后,模型有較深程度的寒證表現(xiàn),并出現(xiàn)虛證。邱賽紅等人選擇分別用冰食醋或氫氧化鈉給大鼠灌胃建立寒證模型,認為食醋法造模所制備的脾胃虛寒模型較氫氧化鈉穩(wěn)定,并與中醫(yī)寒證更接近。周燦平等選用KM種小鼠,采用控制飲食+游泳的方法復制出體虛模型,實驗動物出現(xiàn)典型的臨床“虛寒證”特點。2熱效應動物模型2.1中醫(yī)臨床熱證“氣有余便是火”,氣過盛則易出現(xiàn)火象,表現(xiàn)為實火、實熱證,因此補氣藥可用于實熱證造模。梁氏等選用雌性大白鼠,首先喂黨參、黃芪1周,隨后自皮下注射致熱物松節(jié)油2ml引起發(fā)熱,體溫可達40.30℃,持續(xù)3d,隨后恢復。此種方法克服了單純用黨參或單純用松節(jié)油只引起發(fā)熱,而交感神經(jīng)和內(nèi)分泌變化不大的缺點,更符合臨床實熱證病人的表現(xiàn)。陳群等用黨參、黃芪(1∶1)制成1g/ml的水溶液,4ml/d/只,2周后成功造出實熱證模型。黎敬波以化學因素、中醫(yī)傳統(tǒng)病因、客觀指標為根據(jù),選用Wistar大鼠進行胃潰瘍實熱證造模。采用20%醋酸微量注射導致胃潰瘍,然后施加病因刺激,灌飼辣椒汁、白酒混合液,造成胃實熱證模型。第7d開始檢測指標,結果表明胃潰瘍實熱證模型組造模成功。陳艷芬等采用乙醇或辣椒+乙醇造成胃熱Ⅰ°和Ⅱ°模型,多次試驗結果證實,造模大鼠的一般狀況、胃黏膜的病理組織形態(tài)、微觀指標變化等都符合中醫(yī)臨床熱證的表現(xiàn),并以左金丸反證了熱證模型的成功。山麗梅采用辣椒汁加60°白酒灌胃兩周,最后3d夾尾激怒的方法成功建立了大鼠胃熱證模型。周燦平等選用KM種小鼠,采用飼喂高蛋白飼料的方法復制出體盛模型,實驗動物出現(xiàn)典型的臨床“熱證”特點。田在善以化學因素、客觀指標、藥物反證為依據(jù)復制動物模型,給大鼠尾靜脈注醋酸鉛、5-羥色胺后,立即經(jīng)胃內(nèi)灌注脂多糖,進行腸源性內(nèi)毒素腸熱證造模。其造模結果與中醫(yī)腸熱腑實證基本吻合,且大承氣湯具有明顯的保護作用。另外,模擬發(fā)生熱性病的病因,以細菌、病毒、內(nèi)毒素等作為致毒材料,通過給動物體內(nèi)注大腸桿菌、巴氏桿菌、肺炎雙球菌產(chǎn)生內(nèi)毒素而發(fā)熱,或直接注入內(nèi)毒素而引起實熱證,動物多選用兔或大鼠進行研究。2.2中醫(yī)模型的建立虛熱證動物模型是中醫(yī)證候動物模型中研究較多的1種。以北京醫(yī)科大學研制的較為典型,他們使用溫熱類中藥,以熱甚耗傷陰液為病機,制成虛熱證模型。如用附子、干姜(1∶1)制成100%水煎劑,每日4ml,1次灌胃,3周即可。陳小野等也選用溫熱類中藥如附子、肉桂、仙茅、仙靈脾等份制成水煎劑灌喂雌性小鼠,用藥7d,小鼠表現(xiàn)出一系列的虛熱癥狀?；蚋阶?、干姜、麻黃、蒼術、豬苓等份水煎劑灌喂大鼠,共26周。通過胃黏膜檢測和舌象觀察,其癥狀基本符合中醫(yī)陰虛熱盛證的表現(xiàn)。陳群用附子、干姜、肉桂(1∶1∶1)制成1g/ml的水溶液,4ml/d/只,2周后成功造出虛熱證模型。周小軍等選用清潔級豚鼠,用附子、干姜、肉桂(1∶1∶1)制成180%水煎劑,每天10g/kg灌胃,每天1次,用藥4周制成豚鼠熱證模型。施天華等用附子、干姜(1∶1)制成100%水煎劑,每日4ml,1次灌服,喂藥3周造成虛熱證模型。周永生等改進現(xiàn)行的虛熱證動物模型,加大造模劑量,延長灌胃時間,選擇雌性WistarII級大鼠,按體質分組,用熟附子、肉桂、干姜(1∶1∶1)制成200%煎劑灌胃,4ml/只,每天1次,再以肉桂、干姜(1∶1)制成200%煎劑灌胃,4ml/只,每天2次(實驗第17天起3次/d),用藥28d,發(fā)現(xiàn)造模大鼠不但有熱證表現(xiàn),而且有一定的虛證表現(xiàn)。梁念海等選用SD大鼠,用溫熱中藥干姜作為造模工具藥,給大鼠灌胃干姜水煎劑復制出胃熱證動物模型,并且發(fā)現(xiàn)中、高劑量的干姜水煎劑與辣椒汁和白酒(50%)混合液效果相當。汪文娟用昆明種小鼠灌胃附子干姜肉桂水煎劑,同時5%乙醇代水隨意飲用,3周后造出胃陰虛熱證病理模型。王秋等選用日本大耳白兔,先用禁水禁食和速尿二度利尿脫水造成“陰津虧虛”狀態(tài),再以注射大腸桿菌內(nèi)毒素以致“熱盛”,使受試對象產(chǎn)生陰虛內(nèi)熱的表現(xiàn)。3心溫、熱、常體等體質模型的篩選動物證的模型以從動物中篩選優(yōu)于復制,這符合“證根源于體質”的思想。周志東等選用3月齡SD雄性青年大鼠,于實驗前1月測定大鼠掌溫,每1~2周測溫1次,以各鼠掌溫高于或低于群體均值1℃以上者篩選“熱體”或“寒體”動物。葉福媛等通過測量大鼠蹠心溫度3d,從Wistar大鼠自然群體中,以群體蹠心溫的均值為標準篩選出寒體、熱體、常體等體質模型。張福利等每日測量Wistar大鼠體溫(肛溫)2次,連續(xù)4d,按體溫穩(wěn)定在36.2℃±0.3℃為寒體、37.2℃±0.2℃為常體、大于37.8℃±0.2℃為熱體的標準篩選寒熱體質模型。韓巍等通過測定SD大鼠肛溫,每日1次,雌鼠連續(xù)測定6d,雄鼠連續(xù)5d,以雌鼠、雄鼠群體的平均肛溫為標準,篩選出寒熱體模型。陳小野等選用10種北京市目前常用的Wistar實驗大鼠Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、SDⅠ級、Ⅱ級、Ⅲ級、CD(SD)IGSⅢ級(小體重組)、CD(SD)IGSⅢ級(大體重組)、SHRI級、SHR/spⅠ級,通過檢測外觀、舌象、下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能,運用中醫(yī)學理論進行體質初步分析,篩選出虛寒、虛熱、實熱、正常等體質的大鼠。陳氏等又以8~9周齡昆明、BALB/c、C57BL/6J、ICR小鼠,以及4~5周齡昆明小鼠為研究對象,同步系統(tǒng)檢測其生物學特性,然后以統(tǒng)一的標準評價了這4種品系小鼠的寒、熱體質。4中醫(yī)證候動物模型的復制和驗證近10余年來,國內(nèi)學者對寒熱證動物模型的研制做了許多有益的探索,產(chǎn)生了一些原創(chuàng)性的造模方法和評價標準,推進了動物模型的標準化、客觀化進程,并對其他相關中醫(yī)證候模型的成功復制起到了一定的示范和引領作用。首先是多指標合參思想評價動物模型的引入,更加符合中醫(yī)臨床上以微小證候群為病理基礎的“證”的宏觀整體特征。其次表現(xiàn)在對寒熱證型虛性病理的處理上,根據(jù)中醫(yī)陰盛(寒)必然傷陽,陽盛(熱)必然傷陰的理論,有些研究者開始通過加大造模劑量,延長造模時間,分別復制出陽虛或陰虛的寒熱證候動物模型,使其在寒熱證病理存在的同時保證虛證的存在。另外,以保持自身原有機能狀態(tài)為特征和優(yōu)勢的寒熱自然體質模型的提出和研究也為動物模型擬臨床病理狀態(tài)提供了一種新的模式和方法。盡管如此,寒熱證動物模型的復制仍存在諸多不足和歧義,遠未取得突破性進展。就目前來看,寒熱證動物模型的復制仍多采用寒熱溫度刺激或寒熱性藥物等某一單一因素刺激致病,這顯然有悖于臨床上病人致病因素多樣化的客觀情況,另外,施加因素的刺激強度以及作用時間也缺乏合理的客觀依據(jù)和標準。可見,擬臨床病因的多元化致病因素的聯(lián)合應用研究及其相關標準的建立仍是今后尚需加強和重點研究的方向和領域之一。模型的判定和評價是動物模型制備過程中的一個關鍵環(huán)節(jié),也是模型成功與否的決定因素。盡管寒熱證動物模型的評價指標趨于多樣化,但缺乏與“證”的病理相對應的特異性強的客觀指標,而這些客觀指標的獲取和建立則有賴于證候的客觀化研究。關于這方面的研究,可以借鑒腎陽虛和脾虛證本質研究的思路和成功經(jīng)驗,以臨床病人為突破口,通過選擇典型的寒熱證病人,收集血液、尿液、唾液等容易獲取的樣本,進行生化及組學分析,發(fā)掘能夠表征中醫(yī)“證”的病理狀態(tài)的生物學信息,應該是一條探尋寒熱證“生物標記物”的有效途徑?？傊?中醫(yī)證候動物模型的研制只有在立足于中醫(yī)學整體思維模式的基礎上,充分汲取分子生物學、生物信息學、系統(tǒng)生物學等現(xiàn)代生命科學知識,并不斷融合數(shù)學、化學計量學及數(shù)據(jù)挖掘等方法和手段,提取證候的現(xiàn)代生物學信息,才能逐步增加具有量化標準的客觀指標在證候判斷