食源性致病菌沙門氏菌與奇異變形桿菌二重PCR檢測方法的建立

食源性致病菌沙門氏菌與奇異變形桿菌二重PCR檢測方法的

建立張海霞;孫桂珍;王慧;孫振紅【摘要】目的建立快速檢測食物中致病菌奇異變形桿菌與沙門氏菌的雙重PCR方法.方法根據(jù)奇異變形桿菌尿素酶合成的正向調(diào)節(jié)因子R基因(ureR)和沙門氏菌屬侵襲性抗原保守基因(invA)設(shè)計(jì)特異性引物，建立其雙重PCR檢測方法，并對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果兩對引物分別能擴(kuò)增出374bp和724bp的目的條帶，具有高度特異性，反應(yīng)條件優(yōu)化后，兩菌可同時(shí)檢出的濃度限度為104cfu/ml.結(jié)論該方法特異性和靈敏度高，檢驗(yàn)周期短，可用于對食物中奇異變形桿菌與沙門氏菌的快速診檢和監(jiān)控.【期刊名稱】《泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)》【年(卷)，期】2014(035)003【總頁數(shù)】3頁(P165-167)【關(guān)鍵詞】奇異變形桿菌;沙門氏菌;二重PCR;建立【作者】張海霞;孫桂珍;王慧;孫振紅【作者單位】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院;山東農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院;山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,山東泰安271018;山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,山東泰安271018【正文語種】中文【中圖分類】Q789沙門氏菌和奇異變形桿菌是食品污染的常見致病菌，主要通過食品、飲水感染人類，導(dǎo)致細(xì)菌性食物中毒、腸熱癥、敗血癥等，甚至死亡。近年來，有少量文獻(xiàn)報(bào)道奇異變形桿菌與沙門氏菌屬具有共同抗原，能夠與沙門氏菌屬的多價(jià)血清和因子血清發(fā)生交叉凝集，引起菌種鑒定上的困難［1-2］。隨著分子生物學(xué)檢測的發(fā)展，尤其是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的多重PCR檢測技術(shù)，為實(shí)現(xiàn)多種致病菌的快速同時(shí)檢測提供了廣闊的發(fā)展空間［3］。因此本研究在常規(guī)PCR［4-6］檢測奇異變形桿菌和沙門氏菌的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化PCR條件，建立其雙重PCR檢測體系，為快速同時(shí)檢測奇異變形桿菌和沙門氏菌提供了新的有效手段。1材料與方法1.1材料菌株：奇異變形桿菌1株、沙門氏菌1株、普通變形桿菌1株、大腸桿菌1株、金黃色葡萄球菌1株、單核細(xì)胞增生性李斯特菌1株、蠟樣芽孢桿菌1株，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。主要試劑：rTaq、MgCl2、dNTP、10xPCRBuffer、Marker均購自北京全式金公司。引物：所用引物列于表1。以奇異變形桿菌的ureR基因和沙門氏菌的invA基因?yàn)檠芯繉ο?根據(jù)GenBank中基因序列應(yīng)用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)兩對特異性引物。引物均由南京金斯瑞科技有限公司合成。1.2方法1.2.1細(xì)菌的培養(yǎng)和模板的制備分別挑取奇異變形桿菌和沙門氏菌兩株標(biāo)準(zhǔn)菌單菌落接種于LB培養(yǎng)基,37^振蕩過夜培養(yǎng)。對菌落進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，配制108cfu/ml濃度兩種細(xì)菌菌液，CTAB法［7］提取DNA。表1引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物菌種目的基因NCBI注冊號(hào)引物序列擴(kuò)增長度(bp)奇異變形桿菌ureRAM942759上游5'-TTGGCGAGATTGAGTGCG-3'下游3'-GCACTATTTGGCGGTCGT-5374沙門氏菌invACP001363上游5'-ATTACTTGTGCCGAAGAGCC-3'下游3'-TCCTACAATAAGCGTTTCCC-57241.2.2單一PCR擴(kuò)增及特異性和敏感性分析先對2種菌進(jìn)行單獨(dú)擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25pl,分別為：10xTaq酶buffer2.5pl,MgCl2溶液2.0W，上、下游弓物各1pl(25pmol/L),dNTP2pl(2.5mmol/L),模板DNA2pl,Taq酶0.3pl(5U/pl),其余用去離子水補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性95^5min;每個(gè)循環(huán)條件為94°C變性30s,54°C退火30s,72°C延伸50s,30個(gè)循環(huán)；產(chǎn)物末端72°C延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中，100V電泳40min后，觀察產(chǎn)物條帶。陽性克隆后送往南京金斯瑞科技有限公司進(jìn)行核甘酸序列測定，與GenBank中發(fā)表的相應(yīng)序列進(jìn)行比較。PCR特異性：奇異變形桿菌DNA模板分別加入ureR弓物和invA引物，沙門氏菌DNA模板分別加入invA弓物和ureR引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR敏感性：分別將配制好的108cfu/ml濃度的兩種細(xì)菌菌液，無菌操作按10倍遞增稀釋至濃度為108~101,CTAB法分別提取DNA，進(jìn)行PCR檢測，能檢出的最低細(xì)菌濃度為該體系的靈敏度。1.2.3單管多重PCR反應(yīng)及反應(yīng)體系的優(yōu)化模板DNA4pl(2種菌各2pl),引物4pl(2種引物各2pl),dNTP2pl,Taq酶0.3pl,10xTaq酶buffer2pl,MgCl2溶液3pl,其余用去離子水補(bǔ)足，總體積25pl,擴(kuò)增條件同上。多重PCR體系的優(yōu)化采取固定其它因素，改變某一因素的方式，設(shè)計(jì)L16(43)正交試驗(yàn)，對影響多重PCR結(jié)果的擴(kuò)增條件，如Mg2+濃度、引物濃度、dNTP濃度、退火溫度等進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳的PCR反應(yīng)條件。1.2.4PCR特異性和敏感性測定PCR特異性：兩兩混合1.1.1節(jié)中介紹的7種細(xì)菌，CTAB法分別提取DNA，在優(yōu)化的多重PCR體系條件下擴(kuò)增，進(jìn)行特異性分析。PCR敏感性：將配制好的的108cfu/ml濃度的兩種細(xì)菌菌液，無菌操作按10倍遞增稀釋,使菌液濃度為107~101cfu/ml。取各相同濃度菌液1ml混合，后用CTAB法提取DNA,進(jìn)行PCR檢測后，計(jì)算檢出限。1.2.5人工模擬樣品的檢測采用人工模擬污染經(jīng)檢測2種菌為陰性的肉餡樣品，將2種菌的菌懸液10倍遞增稀釋至含菌量在10~1000cfu/ml后，與肉餡混合，人工染菌的肉餡樣品以1：10加入相應(yīng)的LB增菌液中，過夜培養(yǎng)后,CTAB法提取DNA，將以相同方法和時(shí)間制備的2種菌模板混合成為混合模板，進(jìn)行PCR檢測，同時(shí)對培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。2結(jié)果2.1單一PCR擴(kuò)增和核甘酸序列分析奇異變形桿菌與沙門氏菌模板DNA在加入各自的弓物擴(kuò)增時(shí)，分別得到預(yù)計(jì)的PCR產(chǎn)物片段，即374bp和724bp。經(jīng)克隆測序，奇異變形桿菌擴(kuò)增片段與GenBank中AM942759ureR基因序列同源性為98.9%，沙門氏菌擴(kuò)增片段與GenBank中CP001363invA基因序列同源性為99.6%。2.2單一PCR特異性和敏感性分析奇異變形桿菌模板DNA用invA弓物擴(kuò)增，沙門氏菌模板DNA用ureR弓物擴(kuò)增，均為陰性（圖1）。PCR檢測奇異變形桿菌的靈敏度達(dá)到了103cfu/ml（圖2A）,PCR檢測沙門氏菌的靈敏度達(dá)到了104cfu/m1（圖2B）。M:DNAmarker;1:ureR擴(kuò)增奇異變形桿菌模板DNA;2:ureR擴(kuò)增沙門菌模板DNA;3:invA擴(kuò)增沙門菌模板DNA;4:invA擴(kuò)增沙門菌模板DNA;5:陰性對照圖1奇異變形桿菌、沙門氏菌單一PCR方法特異性檢測結(jié)果圖2A奇異變形桿菌單一PCR方法敏感性檢測結(jié)果（M:DNAmarker;1~8:奇異變形桿菌菌液濃度依次為108~101cfu/ml;9:陰性對照）圖2B沙門菌單一PCR方法敏感性檢測結(jié)果（M:DNAmarker;1-8:沙門菌菌液濃度依次為108~101cfu/ml;9:陰性對照）2.3單管多重PCR的擴(kuò)增及其條件的優(yōu)化初步條件下在同一試管中可同時(shí)擴(kuò)增2種目的基因片段，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示在374bp和724bp處有2條明顯的條帶存在。經(jīng)試驗(yàn)優(yōu)化得到如下的反應(yīng)體系：模板DNA4pl（2種菌各2時(shí)、上下游弓物4pl（2種引物各2|jl）、dNTP2.5pl（2.5mmol/L）、Taq酶0.5pl（5U/pl）.10xTaq酶buffer2.5pl、MgCl2溶液3pl,其余用去離子水補(bǔ)足，總體積25pl。PCR擴(kuò)增條件同單重PCR。2.4PCR特異性和敏感性測定結(jié)果7種菌兩兩混合后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有奇異變形桿菌和沙門氏菌出現(xiàn)特異性條帶，而其它7種細(xì)菌均為陰性（圖3）。從圖4可以看出，在108~104cfu/ml濃度下，兩菌均可同時(shí)擴(kuò)增出較清晰條帶（奇異變形桿菌在103cfu/ml濃度下仍然可見到條帶），與單重PCR靈敏度一致，方法可取。M:DNAmarker;1:奇異變形桿菌和普通變形桿菌；2:沙門菌和大腸桿菌；3:奇異變形桿菌和沙門氏菌；4:金黃色葡萄球菌和大腸桿菌；5:單核細(xì)胞增生性李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌；6普通變形桿菌和大腸桿菌；7大腸桿菌和單核細(xì)胞增生性李斯特菌；8:大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌；9:陰性對照圖3奇異變形桿菌、沙門菌二重PCR方法特異性檢測結(jié)果M:DNAmarker；1-8:菌液濃度依次為108~101cfu/ml；9:陰性對照圖4奇異變形桿菌、沙門菌二重PCR方法敏感性檢測結(jié)果2.5人工模擬結(jié)果人工染菌肉餡中，染菌量在每克樣品中奇異變形桿菌含量83cfu,沙門菌含量40cfu。經(jīng)過增菌培養(yǎng)后，菌量分別達(dá)到奇異變形桿菌7.4x108cfu/ml，沙門菌4.4x107cfu/ml,運(yùn)用前面的多重PCR體系進(jìn)行檢測，能夠擴(kuò)增出相應(yīng)的特異性條帶。實(shí)驗(yàn)證明人工染菌的樣品能夠同時(shí)檢測出所接種的致病菌，并且無非特異性擴(kuò)增，說明該多重PCR檢測方法對食品中存在的奇異變形桿菌和沙門菌有很好的特異性和敏感性。3討論多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展起來的一種新型PCR擴(kuò)增技術(shù)，可同時(shí)檢測多種病原微生物，具有高效、高產(chǎn)、低成本、速度快等優(yōu)點(diǎn)，目前已在多種病原微生物的檢測中得到初步的應(yīng)用［8-11］。本研究在參考別人研究的基礎(chǔ)上，嘗試用多重PCR檢測奇異變形桿菌和沙門氏菌。目的基因的篩選對PCR的特異性非常重要。奇異變形桿菌的ureR基因編碼奇異變形桿菌脲酶調(diào)節(jié)子，林紅樂等［12］通過對2株奇異變形桿菌、14株非奇異變形桿菌以及60份食物中毒送檢標(biāo)本進(jìn)行檢測，顯示該基因具有很高的特異性。沙門氏菌的invA基因編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞的表面抗原，李業(yè)鵬等［13］對77株沙門菌和24株非沙門菌進(jìn)行檢測，表明該基因也有很高的特異性。這都在本實(shí)驗(yàn)中得到了進(jìn)一步的證實(shí)。同時(shí)，引物設(shè)計(jì)時(shí)已排除PCR擴(kuò)增產(chǎn)物間可能發(fā)生的錯(cuò)配，避免引物對間形成黏性末端或部分雙鏈，并對反應(yīng)體系中各成分的使用量、比例、反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，摸索出了最佳退火溫度、引物濃度等，使實(shí)驗(yàn)達(dá)到了最佳效果。本研究初步建立了快速檢測志賀菌、沙門菌和霍亂弧菌的多重PCR體系，實(shí)現(xiàn)了對多種病原體DNA的同步快速擴(kuò)增，為病原微生物的鑒定提供了快速、靈敏、特異的檢測方法，具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。進(jìn)一步規(guī)范后可研制成檢測試劑盒，從而為致病微生物檢測試劑盒的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)：［1］張?jiān)迹娦|,王順東，等.三株與沙門菌有共同抗原的奇異變形桿菌的檢出與分析［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2003,13:788-789.王錦彤，鐘廣輝,熊定凱，等.珠江水中檢出與沙門氏菌具有共同抗原的奇異變形桿菌[J].口岸衛(wèi)生控制,2007,13(2):23-24.張玉霞，黃鳴.食品檢驗(yàn)中多重PCR技術(shù)的應(yīng)用[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,18(5):958-960.MansyMS,FadlAA,AshourMS,etal.AmplificationofProteusmirabilischromosomalDNAusingthepolymerasechainreaction[J].MolCellProbes,1999,13(2):133-1401.LimanskiA,MinukhinV,LimanskaiaO,etal.Species-specificdetectionofProteusvulgarisandProteusmirabilisbythepolymerasechainreaction[J].ZhMikrobiolEpidemiolImmunobiol,2005,3:33-39.CharlottaLfstrom,RickardKnutsson,CharlottaEngdahlAxelsson,etal.RapidandSpecificDetectionofSalmonellaspp.inAnimalFeedSamplesbyPCRafterCultureEnrichment[J].Appl.Environ.Microbiol,2004,70:69-75.AusubelFM,BrentR,KingstonRE,etal.精編分子生物學(xué)指南[M].顏?zhàn)臃f，王海林，譯.北京:科學(xué)出版社,1998:39-40.蔡亦紅,姚余有.3種食源性致病菌的多重PCR快速檢測方法的建立[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2007,17(11):1959-1962.何超,樊學(xué)軍.沙門菌、志賀菌和大腸桿菌O157:H7的多重PCR快速檢測體系的初步探討[J].衛(wèi)生研究,2005,34(6):721-723.MekonnenK,DivindE,Ruth-AnneS,etal.Amultiplexpolymerasechainreactionassayforgenusgroupandspecies-specificdetectionofmycob