發(fā)酵工程制藥-脂類藥物的發(fā)酵制藥

生物制藥工藝課程DHA的發(fā)酵制藥名稱：二十二碳六烯酸（DocosahexaenoicAcid）英文簡稱：DHA俗稱：腦黃金分子式：C22H32O2結(jié)構(gòu)式：

隸屬：多不飽和脂肪酸ω-3系列DHA化學(xué)結(jié)構(gòu)1、輔助腦細(xì)胞發(fā)育2、促進(jìn)光感細(xì)胞的成熟3、抗過敏、增強(qiáng)免疫4、抗氧化、抗衰老5、降低血脂肪6、癌癥的治療DHA生理功效（1）生產(chǎn)工藝之魚油DHA原料：金槍魚和鏗魚油工藝流程：摘出眼窩脂肪煮沸抽提油層分離脫臘脫色脫臭精制DHA油取魚頭DHA生產(chǎn)工藝1、膽固醇含量高，帶有魚腥味2、受季節(jié)、捕撈時(shí)間等條件限制3、氫化處理工藝降低了DHA產(chǎn)量4、DHA含量低，含有大量其他脂肪酸，濃縮困難優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：1、價(jià)格便宜2、含有多種健腦成分生產(chǎn)藻類：隱藻、硅藻等海生異養(yǎng)微藻藻體收集冷凍干燥脂肪酸萃取脂肪酸轉(zhuǎn)酯化分離純化工藝流程：（2）生產(chǎn)工藝之微藻DHA1、生長繁殖快速，富集DHA2、提取工藝較為簡單3、全年進(jìn)行，不受季節(jié)和氣候的影響4、微藻DHA無異味5、生產(chǎn)條件要求不高1、合成具有藻種的特異性2、微藻生長生產(chǎn)受光照、溫度、溶氧量、鹽度、pH值等3、培養(yǎng)周期、培養(yǎng)密度、保存方式也對微藻生產(chǎn)DHA有影響優(yōu)點(diǎn)：

缺點(diǎn)：魚油DHA微藻DHA從深海魚油中提取從海洋微藻中萃取DHA含量低，12%DHA含量高，≥35%DHA乙酯乙酯型DHA不穩(wěn)定且生物利用率低天然的甘油三酯型，較穩(wěn)定，生物利用度高潛在海洋污染（重金屬、有機(jī)污染物）不含海洋污染物魚腥味重?zé)o魚腥味破壞海洋生態(tài)平衡充分利用海洋生物資源 菌種：破囊壺菌和裂殖壺菌（3）生產(chǎn)工藝之真菌DHA工藝流程：1、可人為控制影響因素，保質(zhì)保量2、分離濃縮簡單，制備高純度DHA。1、缺乏高產(chǎn)DHA的優(yōu)質(zhì)菌種2、處于實(shí)驗(yàn)室階段，未能大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)3、從發(fā)酵液中提取DHA的方法不適宜適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)4、微生物可利用的底物較貴，生產(chǎn)成本高

優(yōu)點(diǎn)：

缺點(diǎn)：1、分子蒸餾法：利用混合物組分揮發(fā)度的不同而得到分離2、低溫分級法：利用低溫下混合物組分在有機(jī)溶劑中溶解度不同來進(jìn)行分離3、溶劑提取法：利用脂肪酸鹽在某種有機(jī)溶劑中的差異來分離濃縮DHA提取工藝之各種方法4、尿素包合法：利用脂肪酸與尿素的結(jié)合能力不同5、超臨界CO2萃取法：調(diào)節(jié)溫度和壓力使各組分在超臨界CO2流體中的溶解度發(fā)生大幅度變化而達(dá)到分離6、酶法破碎法：利用酶反應(yīng)分解破壞細(xì)胞壁上的特殊鍵，從而達(dá)到破壁魚油DHA（強(qiáng)弩之末）微藻DHA（如日中天）真菌DHA（后起之秀）應(yīng)用前景之行業(yè)展望應(yīng)用前景之行業(yè)展望由圖可看出：1、增長速度快2、供大于需3、朝陽產(chǎn)業(yè)生物制藥工藝課程番茄紅素的發(fā)酵制藥目錄番茄紅素簡介三孢布拉氏霉菌的發(fā)酵生產(chǎn)紅酵母生產(chǎn)番茄紅素存在問題植物黃金——番茄紅素2023/9/28

番茄紅素（Lycopene）是類胡蘿卜素的一種，是一種很強(qiáng)的抗氧化劑，在清除人體“萬病之源”――自由基方面，番茄紅素的作用比β-胡蘿卜素更強(qiáng)大。

2003年，美國《時(shí)代》雜志把番茄紅素列在“對人類健康貢獻(xiàn)最大的食品”之首，番茄紅素也因此被稱為“植物中的黃金”。

番茄紅素是脂溶性色素，可溶于其他脂類和非極性溶劑中，不溶于水，難溶于強(qiáng)極性溶劑如甲醇、乙醇等，可溶于脂肪烴、芳香烴和氯代烴如乙烷、苯、氯仿等有機(jī)溶劑。

番茄紅素（Lycopene）是一種很強(qiáng)的抗氧化劑，具有極強(qiáng)的清除自由基的能力，對防治前列腺癌、肺癌、乳腺癌、子宮癌等有顯著效果，有效抑制癌細(xì)胞的擴(kuò)散和復(fù)制，還有預(yù)防心腦血管疾病、提高免疫力、保護(hù)細(xì)胞DNA免受自由基損害，防止細(xì)胞病變、突變、癌變；含強(qiáng)力抗氧化生物活物質(zhì)，能促使細(xì)胞的生長和再生，美容袪皺，維持皮膚健康，延緩衰老等功效。它是自然界中最強(qiáng)的抗氧化劑，其抗氧化作用是β-胡蘿卜素的2倍，VE的100倍。2023/9/28番茄紅素功效番茄紅素的結(jié)構(gòu)在自然界中番茄紅素主要以全反式結(jié)構(gòu)存在。而全反式結(jié)構(gòu)是一種具有11個(gè)碳碳共軛雙鍵的非環(huán)狀平面共軛多不飽和脂肪烴，因而它更易于被氧化。而抗氧化性是番茄紅素一切功效的源泉。2023/9/28

1873年，Hartsen首次從番茄漿果中提取出來一種呈深紅色的晶體1903年，Schunch將這種從番茄中提取到的物質(zhì)正式命名為番茄紅素。過去人們一直認(rèn)為，只有那些具備β—紫羅酮環(huán)并能轉(zhuǎn)化為維生素A的類胡蘿卜素，如α—胡蘿卜素、β—胡蘿卜素等才與人類的營養(yǎng)和健康有關(guān)，而番茄紅素因缺乏此結(jié)構(gòu)，不具有維生素A的生理活性，故對此研究很少；但近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素有比其他類胡蘿卜素更好的生物活性，并且是防病治病的重要功能因子，已成為目前國際上功能食品成分研究的一個(gè)熱點(diǎn)。2023/9/28

對番茄紅素的研究在2000年以前鮮有報(bào)道，近幾年驟然升溫，2009-2014年，與番茄紅素有關(guān)的報(bào)道達(dá)1000多篇，內(nèi)容包括：番茄紅素的性質(zhì)和提取方法；番茄紅素及其研究進(jìn)展；番茄紅素的生產(chǎn)工藝研究進(jìn)展等。近10年，僅在中國申請的有關(guān)番茄紅素的國內(nèi)外專利就多達(dá)幾十份。2023/9/28

目前國外有日本、匈牙利、美國、俄羅斯的多家公司申請了關(guān)于番茄紅素生產(chǎn)專利，但只有從鮮番茄中提取番茄紅素的工藝在以色列LycoredNaturalProductsIndustriesLtd實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化大規(guī)模的生產(chǎn)。而中國的番茄紅素開發(fā)亦被納入“國家863計(jì)劃”，受到的高度重視。我國番茄紅素的生產(chǎn)和研究均處于起步階段。、上海的中國華源集團(tuán)有限公司等有限幾家企業(yè)，而華北制藥是全國第一家采用生物發(fā)酵法提取番茄紅素的企業(yè)。另據(jù)報(bào)道由江南大學(xué)和鹽城市瑞智生物技術(shù)有限公司共同研制、開發(fā)的高科技產(chǎn)品天然番茄紅素膠囊目前也已投入批量生產(chǎn)。

番茄紅素的生產(chǎn)工藝2023/9/28生產(chǎn)方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)天然產(chǎn)物提取法天然、綠色、無毒原料來源有很大局限性，生產(chǎn)成本高，不能規(guī)?；a(chǎn)化學(xué)合成法成本低，生產(chǎn)工藝簡單溶劑和重金屬殘留量高，過量食用有毒副作用微生物發(fā)酵法天然、綠色、無溶劑殘留、無重金屬殘留；生產(chǎn)成本低、工藝簡單、周期短、產(chǎn)量高；體內(nèi)吸收率高多集中在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，工業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究還未跟進(jìn)合成番茄紅素的微生物

迄今研究發(fā)現(xiàn)，能夠生產(chǎn)番茄紅素的微生物包括能自身合成番茄紅素的革蘭氏陰性菌、真菌、藻類以及基因工程菌。2023/9/28三孢布拉氏霉菌

三孢布拉氏霉菌以其生長迅速、生物量高、產(chǎn)β-胡蘿卜素能力強(qiáng)在發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素方面展現(xiàn)出較好的工業(yè)化應(yīng)用前景，成為目前唯一能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的一種高產(chǎn)絲狀真菌。2023/9/28三孢布拉氏霉菌的發(fā)酵生產(chǎn)

目前三孢布拉霉的篩選多采用誘變育種和構(gòu)建基因工程菌的方法。

誘變育種:

常規(guī)的物理和化學(xué)誘變方法有紫外、60Co、激光、亞硝基胍、硫酸二乙酯等。缺點(diǎn)：細(xì)胞很難表現(xiàn)出正突變效果,菌種的生產(chǎn)性狀不穩(wěn)定,番茄紅素的產(chǎn)量低。

2023/9/281

菌種選育三孢布拉氏霉菌的發(fā)酵生產(chǎn)

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菌種選育基因工程技術(shù):

1990年Norihiko等報(bào)道在革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)了六個(gè)與類胡蘿卜素合成有關(guān)的基因，分別是CrtE,CrtX,CrtY,CrtI,CrtB和CrtZ，其中CrtE,CrtI和CrtB與番茄紅素的合成有關(guān)，其參與番茄紅素的合成途徑如下所示:

番茄紅素FPPGGPP

八氫番茄紅素CrtECrtICrtB基因工程技術(shù):

構(gòu)建基因工程菌的思路：在一些能夠合成法尼基焦磷酸(FPP)的微生物中插入上述基因，使重組子能夠合成類胡蘿卜素。美國專利報(bào)道將控制番茄紅素合成的基因crtE,crtB,crtI轉(zhuǎn)入擬分枝孢鐮刀菌,得到0.5mg/g細(xì)胞干重的番茄紅素。Wang等[1]通過對紅假單孢球菌(Rhodobactersphaeroides)中八氫番茄紅素脫氫酶的基因crtI進(jìn)行定點(diǎn)突變,使番茄紅素的產(chǎn)率提高到90%。[1]WangCW，LiaoJC．AlterationofproductspecificityofRhodobactersphaeroidesphytoenedesaturasebydirectedevolution．TheJournalofBiologicalChemistry，2001，276(44)：4461～4464

利用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)了從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模走向小規(guī)模產(chǎn)業(yè)化,但工程細(xì)胞攜帶的質(zhì)粒對過程控制條件要求苛刻,易脫落,番茄紅素產(chǎn)量大幅降低。在產(chǎn)業(yè)化過程中,研究者更多的傾向于選擇天然生產(chǎn)菌種,如具有較高生產(chǎn)能力的三孢布拉氏霉菌,這樣就可以避免發(fā)酵工程上游技術(shù)中容易遇到的問題。三孢布拉氏霉菌的發(fā)酵生產(chǎn)

2培養(yǎng)基

盡可能地利用成分簡單且價(jià)格低廉的培養(yǎng)基向來是發(fā)酵工程的宗旨，尤其是利用生物質(zhì)原材料，這就涉及到原材料的選擇及處理問題。最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下:玉米淀粉4%;葡萄糖2.0%;黃豆餅粉1%;大豆分離蛋白3%;玉米漿2%;磷酸二氫鉀0.1%;硫酸鎂0.02%;VB10.5%;油5%;BHT0.05%;pH值為7.2。此配方比較穩(wěn)定,平均色素值為1922mg/L。最終優(yōu)化的中間補(bǔ)料工藝如下:48h補(bǔ)加葡萄糖1.0%,硫酸銨1.0%,磷酸二氫鉀0.1%。此工藝比較穩(wěn)定,平均色素值增加11%。2023/9/28

pH：發(fā)酵液初始pH7.5時(shí)利于番茄紅素的積累,但發(fā)酵過程中控制恒定的pH7.5,對發(fā)酵極為不利。因?yàn)椴徽{(diào)節(jié)pH時(shí),菌體能產(chǎn)生多種有機(jī)酸作為碳源;而調(diào)節(jié)恒定的pH,影響代謝流向。溫度：產(chǎn)生番茄紅素的最佳溫度為25℃,較高的溫度(28℃~30℃)將會增加β-胡蘿卜素和γ-胡蘿卜素的含量,降低番茄紅素的產(chǎn)量。3pH、溫度、攪拌速度和通氣率攪拌速度：提高攪拌轉(zhuǎn)速能夠在一定程度上提高溶氧速率，但高攪拌轉(zhuǎn)速形成的高剪切力，使得菌體受損，生物活性降低致使生物量減小，僅單純加大通氣量，在發(fā)酵處于對數(shù)生長期時(shí)，仍然達(dá)不到要求。通氣率:增加空氣流速,提高空氣中的O2濃度,能夠增加溶氧水平并降低CO2濃度,因此能促進(jìn)番茄紅素的合成。2pH、溫度、攪拌速度和通氣率

在低轉(zhuǎn)速(150r/min)和高通氣率(1.5vvm)時(shí)可以獲得較高的胡蘿卜素產(chǎn)量和生產(chǎn)率;在高轉(zhuǎn)速(500r/min)和中等通氣率下(1vvm),可以獲得較高產(chǎn)率和菌體生物量。2pH、溫度、攪拌速度和通氣率2023/9/283發(fā)酵促進(jìn)劑1.性激素——三孢酸以及結(jié)構(gòu)類似物

三孢酸是一種激素，以β一胡蘿卜素為前體合成，培養(yǎng)基中加入三孢酸可以提高番茄紅素的產(chǎn)量。通過對三孢酸結(jié)構(gòu)類似物結(jié)構(gòu)式的分析，可以確定化合物必須具備1個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)并帶1個(gè)酮基和1個(gè)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)才具有這種生物活性。例如β-紫羅酮、脫落酸、異煙肼、琥珀酰亞胺、檸檬油萜烯和芳香族化合物的結(jié)構(gòu)類似物也有此性質(zhì)。2.氧載體與表面活性劑

三孢布拉霉是高度嗜氧的微生物，從發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方面去改善培養(yǎng)介質(zhì)的性能，可以通過添加氧載體、表面活性劑來提高同一反應(yīng)系統(tǒng)的傳氧系數(shù),從而提高番茄紅素的產(chǎn)量。3.番茄紅素環(huán)化酶抑制劑

生物法生產(chǎn)番茄紅素的關(guān)鍵步驟就是添加番茄紅素環(huán)化酶抑制劑，打斷番茄紅素至β一胡蘿卜素的環(huán)化反應(yīng)，使代謝流停留在番茄紅素階段。常見的番茄紅素環(huán)化酶抑制劑有兩類：叔胺類化合物：主要包括對二甲氨乙基苯酚、2-二甲氨基乙醇、2一二甲氨基一1一丙醇、1一二甲氨基一2一丙醇、3一二異丙基氨基一1一丙醇、1一二異丙基氨基一2一丙醇、三乙胺、2一二甲氨基乙苯等；但目前由于毒性較大，在微生物法生產(chǎn)番茄紅素中較少應(yīng)用。含氮類雜環(huán)化合物：如煙堿、咪唑、吡啶、嗎啉、吡啶、哌啶、喹啉和某些取代衍生物。4.麥角固醇合成抑制劑

番茄紅素和麥角固醇的合成前體都是法尼基二磷酸(FPP)，通過控制麥角固醇的合成，來達(dá)到積累番茄紅素的目的。麥角固醇合成抑制劑,如十二環(huán)嗎啉、嗪氨靈、氟康唑、酮康唑、鹽酸特比萘芬等，抑制合成麥角固醇酶的活性，使得麥角固醇產(chǎn)量降低，從而使類胡蘿卜素產(chǎn)量提高。

三孢布拉霉NRRL2895(+)和NRRL2896(-)正、負(fù)菌株的比例、番茄紅素環(huán)化酶抑制劑砒啶和肌酐、三孢酸結(jié)構(gòu)類似物脫落酸、3-羥基-3-甲基輔酶A(HMG-COA)前體物亮氨酸以及甲羥