甜高粱蔗糖積累規(guī)律及其莖稈汁酒發(fā)酵試驗研究

甜高粱蔗糖積累規(guī)律及其莖稈汁酒發(fā)酵試驗研究

0利用甜高爐特性生產燃料酒精目前，原油是世界能源使用的主要部分，占世界能源使用總額的37%。同時，由于這種不可替代的化石燃料，一些能夠重建、可持續(xù)、高效、低成本、便捷、安全的能源開發(fā)和使用尤為重要。近年來，已經(jīng)出現(xiàn)從可再生的資源中生產酒精用于替代石油燃料的研究。酒精可以從各種含糖的物質原料中獲取，甜高粱是生產酒精原料中較為有前景的原料之一。甜高粱（Sorghumbiocolor(L.)Moench）是一種C4作物，具有很高的光合作用速率，同時與高粱的其他種屬相比，甜高粱具有較高的生物學產量和糖產量。就生物學特性而言，甜高粱生物學產量較高，一般莖稈產量為45000～75000kg/hm2，還可產3000～6000kg/hm2的籽粒；抗逆性強，一般甜高粱具有很強的抗旱和耐澇性，同時還具有較強的抗鹽堿能力；適應范圍廣，只要10℃以上的積溫達到1500°～2500℃，選擇合適的品種，在一般耕地、草原或輕鹽堿地均可種植。作為能源作物而言，甜高粱的莖稈富汁多糖、籽粒富含淀粉、稈渣富含纖維素和半纖維素，均為發(fā)酵制取燃料酒精的合適原料。因此，結合其生物學特性，將其作為一種能源作物用于生成燃料酒精，應具有良好的推廣和應用前景。目前，在甜高粱優(yōu)良品種的選育、栽培和莖稈汁液發(fā)酵制取燃料酒精等方面取得了一定的研究成果，但生產成本較高是限制甜高粱制取燃料酒精發(fā)展的主要障礙，而降低生產成本的主要瓶頸是甜高粱原料可供給的時間較短、酒精生產企業(yè)年實際的生產時間較短以及設備閑置時間較長。因而，本研究從甜高粱的種植期入手，研究同一地區(qū)不同種植期甜高粱莖稈糖分累積的規(guī)律，以選擇在該地區(qū)甜高粱的較好種植時間，以便延長甜高粱莖稈的可供給時間；同時，應用不同的發(fā)酵工藝方式分別對甜高粱莖稈汁液進行酒精發(fā)酵研究，以確定合適的甜高粱莖稈汁液發(fā)酵生產燃料酒精的方式。1材料和方法1.1陽農業(yè)品種—供試品種供試品種為“沈農甜雜2號”甜高粱，由沈陽農業(yè)大學選育，1987年通過遼寧省科委鑒定，為生產酒精的再生能源甜高粱品種；1991年通過國家飼料牧草新品種審定。1.2病毒南陽酵母（Saccharomycescerevisiae），上海交通大學生物質工程研究中心保藏。1.3固定化材料固定化材料選用海藻酸鈉(AR)、氯化鈣(AR)以及戊二醛(BR)等。1.4不同處理的播種量選擇試驗結果試驗于2005年在上海交通大學農業(yè)與生物學院試驗農場進行。土質為黃棕壤，土壤有機質含量為24.821g/kg，含全氮1.798g/kg，堿解氮65.1mg/kg，速效磷17.0mg/kg，速效鉀142.1mg/kg,pH值為7.7。試驗分兩個處理,處理Ⅰ的播種時間為2005年5月2日，小區(qū)面積為64.03m2；處理Ⅱ的播種時間為2005年6月7日，小區(qū)面積為42.69m2。每個處理各設3個重復。種植規(guī)格：壟寬為30cm，壟溝寬為30cm；每壟種1行，行距為60cm，穴距為30cm；種植密度為44000棵/hm2ㄢ種植方式：條播和移栽。施肥方法：農家肥加少量復合肥，用量為12000～15000kg/hm2，拔節(jié)期前追施尿素450～600kg/hm2ㄢ田間管理程序：播種后灌1次水，種植后5～7天松土除草；種植后15天移栽補苗，3～4周后間苗；拔節(jié)前期進行除草大培壟，并灌水1次；中期噴施濃度為0.02%～0.04%的樂果防治蚜蟲。1.5酒精發(fā)酵對比試驗取不同種植期的甜高粱中總糖含量較高、收獲時間較晚的莖稈汁液用于酒精發(fā)酵。同時，酒精發(fā)酵工藝選取固定化酵母和游離態(tài)酵母兩種方式，分別在5L機械攪拌式的生物反應器中進行酒精發(fā)酵對比試驗。發(fā)酵過程中，定時測定發(fā)酵液中酒精含量和總糖含量，對比發(fā)酵過程中原料的酒精轉化率和發(fā)酵時間，以確定較佳的發(fā)酵工藝流程。1.6分析1.6.1甲基紅指示劑溶液制備總糖測定采用3,5-二硝基水楊酸法（DNS）。取2mL甜高粱莖稈汁液于100mL容量瓶，加蒸餾水50mL后，加5mL亞鐵氰化鉀；然后加入5mL乙酸鋅，定容至100mL，離心后從中取50mL溶液于100mL容量瓶，加1MHCl5mL，置于70℃恒溫水浴加熱15min；冷卻后，加2滴甲基紅指示劑，并用20%的NaOH中合至中性定容至100mL，取1～25mL比色管并加入2mLDNS試劑，置于100℃沸水浴中，2min后冷卻定容至25mL；用分光光度計在540nm處比色，測定其吸光度，并查標準曲線計算其濃度。1.6.2以乙酸鈉為原料，，定容、離心取2mL甜高粱莖稈汁液于100mL容量瓶，加蒸餾水50mL后，加5mL亞鐵氰化鉀；然后，加入5mL乙酸鋅，定容至100mL，離心；取1mL清液至25mL比色管，并加入2mLDNS試劑，置于100℃沸水浴中，2min后冷卻定容至25mL，用分光光度計在540nm處比色，測定其吸光度，并查標準曲線計算其濃度。1.6.3瓶中添加0.0.5%自由密封的蒸餾取100mL發(fā)酵成熟醪液到500mL蒸餾瓶中，加100mL蒸餾水混合均勻進行蒸餾；取餾出液100mL，用酒精比重計測定蒸出液的酒精酒度，同時校正至20℃時的酒度。2結果與分析2.1不同種植期甜高爐莖糖和總糖含量的變化甜高粱莖稈汁液富含糖分，可用于發(fā)酵制取燃料酒精，或者直接用于制糖。因而，作為能源作物和糖料作物，甜高粱莖稈糖分的高低是衡量甜高粱莖稈利用價值的重要指標。由于不同種植期的甜高粱在生長環(huán)境的水、熱、光照等條件上具有差異，勢必導致甜高粱莖稈糖分的積累產生一定的差異。甜高粱在苗期至抽穗期主要植株處于營養(yǎng)生長階段，其糖分屬于無積累階段。因而，從抽穗期開始研究甜高粱莖稈的糖分含量具有重要的意義。不同種植期甜高粱抽穗期后天數(shù)與莖稈總糖含量關系如圖1所示。由圖1可知，在上海地區(qū)5月初種植的“沈農甜雜2號”甜高粱和6月初種植的甜高粱其莖稈中總糖的含量都經(jīng)歷先升、后降、再升、再降的過程，呈現(xiàn)“M”變化趨勢。這可能是由于甜高粱在抽穗期后植株主要處于糖分積累快速增長階段，這一時期光照充足，溫度較高，致使植株代謝活動增強、葉片光合作用效率高，除少量光合作用產物用于灌漿外，大部分用于莖的糖分積累，因而莖稈中的總糖含量處于上升趨勢。此后，甜高粱籽粒形成并逐漸加快生長，導致甜高粱莖稈糖分積累緩慢，總糖含量呈下降趨勢，而后出現(xiàn)莖稈糖分升降的波動。從總糖波動變化的時間上看，6月初種植的甜高粱要比5月初種植的甜高粱晚一周左右。這說明，在試驗范圍內，推遲甜高粱的播種期25～30天左右，能延長甜高粱糖分在莖稈中保持時間10～14天。兩個播種期的甜高粱都是在抽穗期后21天左右出現(xiàn)了第一次總糖積累的峰值，且后一播種期的甜高粱的總糖積累量要高于前一播種期。這說明，在上海地區(qū)6月份以后的氣候較為適合“沈農甜雜2號”甜高粱的莖稈生長期糖分積累。從莖稈糖含量的平均水平上來看，6月初種植的甜高粱的莖稈總糖含量的平均水平為127.37mg/mL，而5月初種植的甜高粱則為68.14mg/mL,6月初種植的甜高粱的莖稈總糖含量的平均水平比5月份初種植的甜高粱高出46.5%。還原糖含量的平均水平分別為34.4mg/mL和31.05mg/mL，兩者差異不大。多水分、低溫度和少光照條件將會降低甜高粱莖稈糖分的含量。不同種植期甜高粱抽穗后天數(shù)與莖稈還原糖含量的關系如圖2所示。甜高粱莖稈汁液中的還原糖主要是葡萄糖和果糖。由圖2可以看出：兩個種植期的甜高粱在抽穗后莖稈中還原糖含量波動變幅不大。結合圖1還可看出，還原糖和總糖含量呈現(xiàn)一種互補的趨勢，即在總糖含量有大幅增加時，還原糖含量出現(xiàn)下降趨勢；總糖含量大幅減小時，還原糖含量出現(xiàn)上升趨勢。這說明，甜高粱光合作用最初在莖稈中的產物是葡萄糖。在植物生理中，葡萄糖和果糖是合成蔗糖的物質基礎。糖是甜高粱作為能源作物和糖料作物的物質基礎，結合上面分析的糖分變化規(guī)律，在上海地區(qū)種植“沈農甜雜2號”甜高粱作為能源作物和糖料作物，其播種期應考慮選擇在5月末或6月初。因而，通過調節(jié)甜高粱的播種期可以延長其收獲期和糖分在莖稈中的保持期，對充分利用糖廠和酒精廠的加工設備、降低燃料酒精成本具有一定的意義。2.2固定化酵母發(fā)酵工藝在本研究中供試的甜高粱為5月初種植，采收于2005年12月4日，其莖稈經(jīng)壓汁后，向汁液添加0.2%的(NH4)2SO4,0.125%的K2HPO4和0.05%的MgSO4等無機營養(yǎng)鹽，并滅菌。用1MHCl和1MNaOH調節(jié)pH值至4.5后，用于固定化酵母酒精發(fā)酵和游離態(tài)酒精發(fā)酵試驗。發(fā)酵條件：溫度為（31±0.1）℃，轉速為（150±5)r/min。發(fā)酵結果如圖3和圖4所示。由圖3可以看出，固定化酵母發(fā)酵甜高粱莖稈汁液制取酒精的整個發(fā)酵時間為7h，而游離態(tài)酵母酒精發(fā)酵的總發(fā)酵時間為22h。對于同一糖度水平的甜高粱莖稈汁液而言，運用固定化技術發(fā)酵制取酒精相對于傳統(tǒng)的游離態(tài)發(fā)酵技術可以縮短發(fā)酵時間至原來的1/3左右；同時，在固定化酵母酒精發(fā)酵過程中，平均總糖轉化速度為11.29g/h·L，最大的糖轉化速率為15.54g/h·L。而對于游離態(tài)酵母酒精發(fā)酵，其平均的總糖轉化速率為3.70g/h·L，其中最大的糖轉化速率為10.36g/h·L。兩者之間的最大糖轉化速率相差不多，而平均轉化速率固定化酵母酒精發(fā)酵比游離態(tài)酵母酒精發(fā)酵高出67.22%，說明固定化技術發(fā)酵制取酒精技術具有較高的啟動速率，而且整個發(fā)酵過程中發(fā)酵速率比較穩(wěn)定，并保持較高的發(fā)酵速率。由圖4可以看出，在發(fā)酵過程中，固定化酵母和游離態(tài)酵母發(fā)酵甜高粱莖稈汁液最終所獲得酒精濃度分別為4.3%（v/v）和4.2%（v/v）。固定化酵母酒精發(fā)酵的平均酒精生成速率為4.88g/h·L，最大酒精生成速率為6.40g/h·L；而對于游離態(tài)酵母酒精發(fā)酵，其最大的酒精生成速率僅為1.53g/h·L，而最大的酒精生成速率為3.40g/h·L。通過比較兩種發(fā)酵方式的酒精得率可以看出，固定化技術的酒精得率為85.34%，而游離態(tài)酵母發(fā)酵的酒精得率為81.02%。通過對圖3和圖4的分析表明，固定化酵母發(fā)酵制取酒精技術在發(fā)酵時間、發(fā)酵速率以及酒精得率等方面的指標均明顯優(yōu)于游離態(tài)的酒精發(fā)酵。其主要原因是在酒精發(fā)酵過程中存在著發(fā)酵底物和發(fā)酵產物對酵母代謝的抑制；而在固定化酵母細胞發(fā)酵制取酒精的系統(tǒng)中，酵母細胞的密度較大，且具有較高的微生物活性，同時該系統(tǒng)的發(fā)酵過程還是一個傳質與代謝同時存在的過程，因而傳質的存在減弱了底物抑制和產物抑制的作用，而固定化系統(tǒng)中較高的酵母細胞密度和較高的微生物活性提高了發(fā)酵反應的速率。因而，固定化酵母技術用于甜高粱莖稈汁液發(fā)酵制取酒精較傳統(tǒng)的游離態(tài)酵母發(fā)酵制取酒精具有較高的發(fā)酵速率和發(fā)酵穩(wěn)定性；同時，固定化酵母粒子容易制備，且成本較低，還可以在連續(xù)酒精發(fā)酵過程中反復使用，節(jié)約了培養(yǎng)酵母的能耗和原料。因此，在應用甜高粱莖稈汁液發(fā)酵制取燃料乙醇的工藝中，應用固定化酵母技術是一種較為合適的工藝類型。它可以通過縮短發(fā)酵周期來減少因甜高粱貯存而需要消耗的能量，同時還可以在酒精生產過程中提高生產設備的利用率水平，以提高經(jīng)濟效益。3不同酵母發(fā)酵甜高爐秸稈制備的對比試驗1)通過比較不同播種期的甜高粱在其糖分積累期的糖分積累規(guī)律以及糖分變化規(guī)律可以得出，其總糖含量自抽穗期以后呈“M”型變化規(guī)律。6月初種植的甜高粱其莖稈汁液的總糖含量的平均水平比5月初種植的甜高粱高46.50%，而還原糖含量的平均水平分別